Ο υποδοχέας οιστρογόνων βήτα ως άμεσος ρυθμιστής της μιτοχονδριακής λειτουργίας

Abstract

Estrogens are crucial regulators of the nervous system physiology, exerting anti-oxidant, anti-apoptotic and anti-inflammatory actions. They act via binding to their cognate nuclear, mitochondrial and membrane estrogen receptors (ERs), but also in an ER-independent manner. Recently, the neuroprotective effect of mitochondrial ERs, especially mitochondrial ERβ (mtERβ), has been documented. The exact mechanism of mtERβ action in this organelle has not been fully elucidated and is the subject of study by various research groups. Considering the significant role of mitochondria in the maintenance of neurons survival and function, the characterization of the role and the biochemical mechanisms of the actions of mtERβ in neural cells is of great importance. In this context, the aim of this PhD thesis was the characterization of the direct action of mtERβ on several mitochondrial processes, such as mitochondrial transcription, energy production, anti-oxidant defense, mitochondria-associated apoptosis, as well as the elucidation of mtERβ effects on carcinogenesis, cell differentiation and defense against neurotoxic agents. To this aim, a stable mouse neuroblastoma cell line Neuro-2a (N2A) overexpressing a mitochondrial-targeted ERβ (mtERβ) fused with the green fluorescent protein (N2AmtGFPERβ), and a control Ν2Α cell line stably overexpressing a mitochondrial-targeted GFP (N2ΑmtGFP), was generated. The produced stable cell lines along with the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, that exhibits considerable endogenous ERβ protein levels with mitochondrial ERβ localization as well, were cultured in the presence or absence of a specific inhibitor of nuclear transcription or differentiation- or neurotoxicity-inducing factors, in order to study the role of mtERβ in mitochondrial function, by applying real-time PCR, fluorescence microscopy, immunocytochemistry and Western blotting, measurement of ATP levels or / and MTT assays. Moreover, stable cell lines were used for the development of a xenograft mouse model, for in vivo tumorigenesis studies. The results of this PhD thesis revealed the direct involvement of mtERβ in the activation of mitochondrial transcription and ATP production, even in the presence of a specific inhibitor of nuclear polymerase and in the presence or absence of estradiol (Estradiol, E2), in both the SH-SY5Y and N2AmtGFPERβ cells. Furthermore, investigation of the role of mtERβ in the regulation of neural cell differentiation uncovered the involvement of mtERβ in neuronal differentiation as indicated by the statistically significant increase in the neuronal length and Tuj-1 protein levels in mtERβ-overexpressing cells, compared to control cells. Moreover, the increased anti-apoptotic and anti-oxidant defense of mtERβ-overexpressing N2A cells, in the presence of apoptosis- and oxidative stress- inducing factors compared to the control cells, demonstrate the direct involvement of mtERβ in the regulation of apoptosis and oxidative stress, verifying the neuroprotective effect of mtERβ. The actions and effects of the mtERβ actions were confirmed and further investigated by applying a xenograft mouse model of mtERβ-overexpressing N2A cells. In tumorigenesis studies, the direct action of mtERβ in the regulation of mitochondrial transcription was also verified. Thus, in mtERβ expressing tumors the increased synthesis of OXPHOS subunits was observed that possible lead to the enhancement of energy production through the respiratory chain - OXPHOS. Our findings indicate that these mtERβ-induced actions contribute to the inhibition of carcinogenesis, through direct or indirect regulation of other biochemical mechanisms such as, cellular energy metabolism, mitophagy and cell cycle, thereby reversing the trends for metabolic reprogramming observed in Warburg effect. Finally, the study of both the potential estrogenic action of aluminum (Aluminium, Al) and the involvement of this action in Al-induced neurotoxicity, highlighted the Al-induced reduction in ERβ protein levels. This action may be linked to the observed involvement of Al in the phosphorylation at S118 residue of ERα, which cause the inhibition of ERα proteolytic degradation and the increase of ERα protein levels. Increased ERα levels, as we know from the literature, induce the reduction in ERβ protein levels and consequently ERβ-induced neuroprotective action. In addition, the neurotoxic effect of Al could be attributed to the observed Al-induced increase in mitochondrial localization of ERβ, possibly triggering mitochondrial metabolism and increasing production of ROS and induction of apoptosis. In summary, the results of the present PhD thesis support the direct action of mtERβ in the regulation of mitochondrial function in both normal and pathological conditions, rendering mtERβ a potential pharmaceutical target for mitochondrial related diseases, such as cancer and neurodegenerative diseases.

Τα οιστρογόνα αποτελούν βασικούς ρυθμιστές της λειτουργίας του νευρικού συστήματος, ασκώντας αντιοξειδωτικές, αντιαποπτωτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις. Οι δράσεις αυτές των οιστρογόνων επιτελούνται μέσω πυρηνικών και μεμβρανικών ERs (Estrogen Receptors, ERs), αλλά και ανεξαρτήτως ERs. Τελευταία αναδεικνύεται και η νευροπροστατευτική δράση των μιτοχονδριακών ERs, και κυρίως του μιτοχονδριακού ERβ (mitochondrial ERβ, mtERβ). Ο ακριβής μηχανισμός δράσης του mtERβ στο συγκεκριμένο οργανίδιο δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως και αποτελεί αντικείμενο μελέτης αρκετών ερευνητικών ομάδων. Συνυπολογίζοντας το σημαντικό ρόλο των μιτοχονδρίων στη διατήρηση της βιωσιμότητας και της εύρυθμης λειτουργίας των νευρώνων αναδεικνύεται η σημαντικότητα του χαρακτηρισμού του ρόλου και των μηχανισμών άμεσης δράσης του mtERβ σε νευρικά κύτταρα. Με βάση τα προαναφερθέντα στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η άμεση δράση του mtERβ σε μια πληθώρα μιτοχονδριακών διεργασιών, όπως η μιτοχονδριακή μεταγραφή, η παραγωγή ενέργειας, η αντιοξειδωτική άμυνα και η σχετιζόμενη με το μιτοχόνδριο απόπτωση, καθώς και οι επιπτώσεις των επαγόμενων από τον mtERβ δράσεων στην καρκινογένεση, στην κυτταρική διαφοροποίηση, και στην άμυνα έναντι νευροτοξικών παραγόντων. Για την επίτευξη των στόχων της παρούσας διδακτορικής διατριβής κατασκευάστηκε κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος ποντικού Neuro-2a (Ν2Α) που υπερεκφράζει τον ERβ υπό μορφή χιμαιρικής πρωτεΐνης με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green fluorescent protein, GFP) με μιτοχονδριακή στόχευση (Ν2AmtGFPERβ), καθώς και κυτταρική σειρά αναφοράς, που υπερεκφράζει σταθερά την πρωτεΐνη mtGFP (Ν2ΑmtGFP). Οι κυτταρικές αυτές σειρές, μεταξύ άλλων, χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή in vivo πειραμάτων καρκινογένεσης σε μύες (xenograft mouse model). Επιπρόσθετα, σε μια πληθώρα πειραματικών διαδικασιών, χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος ανθρώπου SH-SY5Y καθώς εμφανίζει, σε σύγκριση με αντίστοιχες κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος, αυξημένα ενδογενή πρωτεϊνικά επίπεδα και μιτοχονδριακή εντόπιση του ERβ. Στις προαναφερθείσες κυτταρικές σειρές (Ν2ΑmtGFP, Ν2ΑmtGFPERβ και SH-SY5Y) πραγματοποιήθηκαν μελέτες που περιλάμβαναν αρχικά καλλιέργεια κυττάρων παρουσία και απουσία ειδικού αναστολέα πυρηνικής μεταγραφής, παρουσία και απουσία παραγόντων διαφοροποίησης και επαγωγής νευροτοξικότητας, και στη συνέχεια εφαρμογή διαφόρων μεθόδων όπως PCR πραγματικού χρόνου, μικροσκοπία φθορισμού, ανοσοφθορισμό και ανοσοαποτύπωση κατά Western με χρήση ειδικών αντισωμάτων, μέτρηση των επιπέδων ATP και δοκιμασίες ελέγχου κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αναδεικνύουν την άμεση εμπλοκή του mtERβ στην ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής μεταγραφής και της παραγωγής ATP μέσω της αναπνευστικής αλυσίδας – οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (OXPHOS), δεδομένου ότι παρατηρήθηκε ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής μεταγραφής, παρουσία αναστολέα πυρηνικής μεταγραφής και παρουσία ή απουσία οιστραδιόλης (17β-estradiol, Ε2), και αύξηση των επιπέδων της μιτοχονδριακής ATP τόσο σε κύτταρα SHSY-5Y, όσο και σε κύτταρα N2AmtGFPERβ. Επιπλέον μελετήθηκε ο ρόλος του υποδοχέα στη ρύθμιση μηχανισμών διαφοροποίησης νευρικών κυττάρων, χρησιμοποιώντας μοντέλο ανάπτυξης κυττάρων σε συνθήκες διαφοροποίησης, όπου παρατηρήθηκε η διαφοροποίηση των κυττάρων που υπερεκφράζουν τον mtERβ, όπως υποδεικνύει η παρατηρούμενη αύξηση του μήκους των νευρώνων και των πρωτεϊνικών επιπέδων του δείκτη διαφοροποίησης βIII τουμπουλίνη (βIII-tubulin, Tuj-1) στη συνθήκη αυτή, σε σύγκριση με τα κύτταρα αναφοράς. Επίσης, η αυξημένη αντιαποπτωτική και αντιοξειδωτική άμυνα των κυττάρων Ν2Α, που υπερεκφράζουν τον mtERβ, σε συνθήκες επαγωγής απόπτωσης και οξειδωτικού στρες, αποδεικνύουν την άμεση εμπλοκή του mtERβ στη ρύθμιση της απόπτωσης και του οξειδωτικού στρες, επαληθεύοντας έτσι την νευροπροστατευτική δράση του υποδοχέα. Οι δράσεις και οι επιπτώσεις των δράσεων αυτών του mtERβ επαληθεύτηκαν και διερευνήθηκαν περαιτέρω πραγματοποιώντας in vivo πειράματα καρκινογένεσης σε μύες. Κατά τη διεξαγωγή των μελετών αυτών επαληθεύτηκε η άμεση δράση του υποδοχέα στη ρύθμιση της μιτοχονδριακής μεταγραφής, η οποία οδηγεί στην αυξημένη σύνθεση υπομονάδων OXPHOS και κατ’ επέκταση στην ενίσχυση της παραγωγής ενέργειας μέσω της αναπνευστικής αλυσίδας – OXPHOS. Επίσης διαπιστώθηκε ότι οι προαναφερθείσες δράσεις του mtERβ συντελούν στην αναστολή της καρκινογένεσης, μέσω άμεσης ή έμμεσης ρύθμισης και άλλων βιοχημικών μηχανισμών όπως του κυτταρικού ενεργειακού μεταβολισμού, της μιτοφαγίας και του κυτταρικού κύκλου, αναστρέφοντας έτσι τάσεις για μεταβολικό επαναπρογραμματισμό που έχουν παρατηρηθεί στο φαινόμενο Warburg. Τέλος, η μελέτη τόσο της πιθανής οιστρογονικής δράσης του αργιλίου (Aluminum, Al) όσο και της εμπλοκής αυτής στην εκδήλωση της νευροτοξικότητας του αργιλίου, ανέδειξε την επαγόμενη από το Al μείωση των επιπέδων του ERβ. Η δράση αυτή πιθανώς να οφείλεται στην παρατηρούμενη εμπλοκή των ιόντων Al στην κατάσταση φωσφορυλίωσης του ERα στο αμινοξύ S118, που οδηγεί σε αναστολή της πρωτεολυτικής του αποικοδόμησης και συνεπώς σε αύξηση των πρωτεϊνικών του επιπέδων, τα οποία επάγουν με τη σειρά τους, όπως γνωρίζουμε από τη βιβλιογραφία, τη μείωση των επιπέδων του ERβ και κατά συνέπεια τη μείωση της νευροπροστατευτικής του δράσης. Επίσης η νευροτοξική δράση του Al θα μπορούσε να αποδοθεί στην παρατηρούμενη από το Al αύξηση της μιτοχονδριακής εντόπισης του ERβ, η οποία πιθανόν να οδηγεί σε υπερλειτουργία της αναπνευστικής αλυσίδας – OXPHOS, αυξημένη παραγωγή ROS και επαγωγή απόπτωσης. Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής υποστηρίζουν την άμεση δράση του mtERβ στη ρύθμιση της μιτοχονδριακής λειτουργίας τόσο σε φυσιολογικές όσο και παθολογικές συνθήκες αναδεικνύοντας τον ως έναν εν δυνάμει φαρμακευτικό στόχο για τη ρύθμιση της μιτοχονδριακής λειτουργίας σε σχετιζόμενες με μιτοχόνδρια παθήσεις όπως καρκινογένεση και νευροεκφυλιστικές νόσοι.