Νέες στρατηγικές επαγωγής ανοσολογικής ανοχής έναντι αυτοαντιγόνων μυελίνης για τη θεραπεία της σκλήρυνσης κατά πλάκας

Abstract

Autoimmune diseases of the CNS, such as multiple sclerosis (MS), are the main cause of non-traumatic disability in young adults. Adaptive immunity in co-operation with innate immunity, not only overcome the immune privilege mechanisms that protect the CNS against foreign threats, but also peripheral immune tolerance mechanisms towards self, and trigger an immune response against the myelin sheath, that protects and insulates the neurons. This results in inflammation, demyelination, glial cell activation and problems in neural transmission that are responsible for neuronal deficits. Critical mediators of CNS demyelinating diseases are T cells, B cells and monocytes/macrophages, that are abundant in the CNS lesions. Approved therapies are only partially effective and are often associated with adverse effects, because of the general immunosuppression they induce. Therefore, there is a need for targeted therapies that more specifically target the cells responsible for myelin destruction, without affecting other immune responses. The goal of current research is the development of antigen-specific therapies for the treatment of autoimmune demyelination.Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a valuable tool in developing such therapies, as it is the most widely used model of human autoimmune demyelinating diseases. EAE model shares some common immunological and pathophysiological mechanisms with MS, neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD) and myelin oligodendrocyte glycoprotein associated disease (MOGAD). Myelin-specific Th1 and Th17 CD4+ cells are both necessary and sufficient to induce disease. Together with antigen-specific T cells, myeloid cells are key mediators of EAE, and the relative contribution of blood borne monocytes and tissue resident macrophages, in disease pathology and tissue recovery is the subject of current research. Previously we showed that oxidized mannan (OM) conjugated myelin autoantigens induce antigen-specific tolerance in EAE and protect mice from the clinical and histopathological signs of the disease. Our studies showed that tolerance is associated with reduced antigen-specific T cell proliferation, without involving other classical mechanisms of T cell tolerance, namely, clonal T cell deletion, the maturation of Th1 and Th17 cells, Th1/Th2 immune deviation, or the induction of Tregs in peripheral lymphoid organs. Further in vitro and in vivo studies showed that in addition to reduced antigen-specific proliferation, T cells also had produced less of the growth cytokine IL-2 and its receptor CD25, all features of T cell anergy. Nevertheless, the mechanism of anergy remained elusive.In this thesis we further investigated the therapeutic effects of OM conjugated MOG peptide 35-55 (OM-MOG) in EAE, to gain in depth insight into the mechanism of tolerance. CD4+ T cells from the spleens of OM-MOG vaccinated mice have an anergic phenotype, with high expression of CD44 and of folate receptor FR4, while exhibiting normal polyclonal responses, further showing that the tolerance is antigen-specific. Studies in humanized HLA-DR2b transgenic mice (DR2b.Ab°), that lack all murine MHC class II (MHCII) molecules and are susceptible to MOG35-55 induced EAE, showed that OM-MOG protects and treats the clinical and histopathological symptoms of EAE further supporting that tolerance is independent of MHCII type. The histopathological analysis of DR2b.Ab° mice spinal cords, showed that OM-MOG reduced inflammation, demyelination and neuronal damage. Further studies in C57BL/6 (Β6) mice showed the preservation of axonal integrity in spinal cord lesions and the increase in expression of genes associated with myelin (Mbp encoding myelin basic protein/MBP) and neuron recovery (Snap25 encoding synaptosomal-associated protein 25kDa/SNAP25) by OM-MOG. Immune tolerance by OM-MOG involved the rapid upregulation of PD-L1 and IL-10 production by myeloid cells, and gene markers of alternative activation (Ym1 encoding chitinase 3 like 3/CHI3L3) in secondary lymphoid organs, all features associated with a type 2 myeloid response. To investigate the cellular basis of tolerance, we further investigated the involvement of two immature myeloid cell populations with phenotype CD11b+Ly6G (Ly6G) and CD11b+Ly6Chi (Ly6Chi) in EAE, which along with T cells are necessary for the induction of EAE but also could directly mediate immune tolerance by their properties as myeloid derived suppressor cells (MDSC). Immature Ly6Chi cells that express the CCR2 receptor are known to be critical for the development of EAE. They migrate from the periphery to the CNS and mature within the CNS to exhibit their pathogenic roles. Therapeutic OM-MOG induces tolerance by prematurely inducing the maturation of Ly6ChiCCR2+ to Ly6ChiMHCII+PD-L1+ cells in the periphery, prior to their migration to the CNS, and thereby inhibiting spinal cord inflammation and demyelination in EAE mice. Soluble intradermal OM-MOG, drains directly to the skin draining lymph node to be sequestered by CD169+ subcapsular sinus macrophages, activates Ly6ChiCCR2+ monocytes to produce MHCII and PD-L1, preventing the trafficking of immune cells in the spinal cord and reversing the established lesions. To investigate the molecular basis, we also showed that PD-L1 is a critical mediator of immune tolerance, by using a neutralizing anti-PD-L1 antibody in vivo. Using the dendritic cell-specific Pdl1 knockout mice, we demonstrated that PD-L1 in non-dendritic cells is essential for the therapeutic effects of OM-MOG. These results show that the maturation of circulating Ly6ChiCCR2+ monocytes by OM-myelin peptides represents a novel mechanism of peripheral antigen-specific immune tolerance that reverses EAE, and a promising strategy for the design of therapies against autoimmune diseases with identified autoantigens.

Οι αυτοάνοσες νόσοι του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ), όπως η Σκλήρυνση κατά Πλάκας (ΣκΠ), αποτελούν την κύρια αιτία μη τραυματικής δυσλειτουργίας σε νεαρούς ενήλικες. Η προσαρμοστική ανοσία, σε συνεργασία με τη φυσική, παρακάμπτουν τόσο τους μηχανισμούς που προφέρουν προστασία στο νευρικό ιστό από ξένες απειλές, όσο και τους μηχανισμούς περιφερικής ανοχής έναντι του εαυτού, εκκινώντας μία ανοσολογική απόκριση κατά της μυελίνης, η οποία προστατεύει και μονώνει τους νευρώνες. Αποτέλεσμα είναι η φλεγμονή, η απομυελίνωση, η ενεργοποίηση των κυττάρων της γλοίας και η προβληματική μετάδοση των δυναμικών ενέργειας που οδηγεί σε νευρολογικά ελλείματα. Κύριοι μεσολαβητές των νόσων αυτών είναι τα Τ και Β κύτταρα, καθώς και τα μονοκύτταρα/μακροφάγα, τα οποία εντοπίζονται στις απομυελινωτικές εστίες σε αφθονία. Οι εγκεκριμένες θεραπείες για τις νόσους αυτές είναι ως ένα βαθμό αποτελεσματικές, αλλά προκαλούν την μερική ή γενικευμένη ανοσοκαταστολή του οργανισμού, η οποία προκαλεί συχνά δυσάρεστες παρενέργειες. Υπάρχει λοιπόν ανάγκη για πιο στοχευμένες θεραπείες, οι οποίες θα επικεντρώνονται στην καταστολή μόνο των κυττάρων που είναι υπεύθυνα για την καταστροφή της μυελίνης, αφήνοντας ανεπηρέαστες τις υπόλοιπες ανοσολογικές αποκρίσεις. Στόχος των σύγχρονων ερευνών είναι η ανάπτυξη αντιγονοειδικών θεραπειών για τις αυτοάνοσες απομυελινωτικές νόσους.Στην κατεύθυνση αυτή, πολύτιμο εργαλείο αποτελεί το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο αυτοάνοσης απομυελίνωσης, η πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (ΠΑΕ). Το μοντέλο αυτό μοιράζεται κοινούς ανοσολογικούς και παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς με την ΣκΠ, αλλά και με άλλες ασθένειες όπως η διαταραχές του φάσματος της οπτικής νευρομυελίτιδας (neuromyelitis optica spectrum disorders, NMOSD) και η νόσος που σχετίζεται με την παραγωγή αντισωμάτων έναντι της μυελινικής γλυκοπρωτεΐνης των ολιγοδενδροκυττάρων (myelin oligodendrocyte glycoprotein associated disease, MOGAD), και μεσολαβείται από τα μυελινοειδικά Th1 και Th17 CD4+ κύτταρα. Μαζί με τα αντιγονοειδικά Τ κύτταρα, τα μυελοειδή κύτταρα είναι και αυτά κύριοι μεσολαβητές της ΠΑΕ. Η συμβολή των μονοκυττάρων του αίματος και των μακροφάγων που βρίσκονται μόνιμα στον ιστό στην παθολογία της νόσου, αλλά και στην επούλωση, αποτελεί αντικείμενο των σύγχρονων ερευνών. Σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας στην ΠΑΕ δείχθηκε πως τα συζευγμένα με οξειδωμένη μαννάνη (OM) αυτοαντιγόνα μυελίνης επάγουν αντιγονοειδική Τ κυτταρική ανοχή και προστατεύουν τους ποντικούς από τα κλινικά και ιστοπαθολογικά σημεία της νόσου. Οι μελέτες αυτές έδειξαν πως η ανοχή σχετίζεται με τον μειωνένο αντιγονοειδικό Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό, χωρίς να επηρεάζεται η ωρίμανση των Th1 και Th17 κυττάρων ή να εμπλέκονται άλλοι γνωστοί μηχανισμοί Τ κυτταρικής ανοχής, όπως η κλωνική εξάλειψη, η μετατροπή από Th1 σε Th2, ή η επαγωγή των Tregs στα περιφερικά λεμφικά όργανα. Επιπλέον in vitro και in vivo μελέτες έδειξαν πως τα Τ κύτταρα είχαν μειωμένη παραγωγή της κυτταροκίνης IL-2 και του υποδοχέα της CD25, τα οποία μαζί με τον μειωμένο Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό αποτελούν χαρακτηριστικά Τ κυτταρικής ανέργειας. Ωστόσο ο ακριβής μηχανισμός ανέργειας δεν έχει αποσαφηνιστεί.Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε περαιτέρω τις θεραπευτικές δράσεις του συζευγμένου με ΟΜ πεπτιδίου 35-55 της MOG (OM-MOG) στην ΠΑΕ, και επιχειρήσαμε να κατανοήσουμε σε βάθος το μηχανισμό δράσης του. Τα CD4+ κύτταρα από το σπλήνα εμβολιασμένων με OM-MOG ποντικών, εμφανίζουν ανεργικό φαινότυπο με υψηλή έκφραση CD44 και του υποδοχέα φυλλικού οξέος FR4, ενώ εκδηλώνουν φυσιολογικά τις πολυκλωνικές αποκρίσεις πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων, δείχνοντας πως η ανοχή είναι αντιγονοειδική. Επιπλέον μελέτες στους ανθρωποποιημένους HLA-DR2b διαγονιδιακούς ποντικούς (DR2b.Ab°), που στερούνται ποντικίσιων μορίων MHC τάξης ΙΙ (MHCII) και είναι επιρρεπείς στην ΠΑΕ που επάγεται από MOG35-55, ανέδειξαν την προστατευτική και θεραπευτική δράση του OM-MOG στην κλινική και ιστοπαθολογική εικόνα των ποντικών αυτών, δείχνοντας περαιτέρω ότι η ανοχή είναι ανεξάρτητη των MHCII μορίων. Η ιστοπαθολογική μελέτη στους DR2b.Ab° ποντικούς, έδειξε πως το OM-MOG μείωσε τη φλεγμονή και την απομυελίνωση του νωτιαίου μυελού, καθώς και την νευρωνική βλάβη. Περαιτέρω θεραπευτικές μελέτες σε C57BL/6 (Β6) ποντικούς έδειξαν τη διατήρηση της ακεραιότητας των αξόνων στις εστίες του νωτιαίου, αλλά και αύξηση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την επιδιόρθωση της μυελίνης (Mbp, που κωδικοποιεί την myelin basic protein/MBP) και των νευρώνων (Snap25 που κωδικοποιεί την synaptosomal-associated protein 25kDa/SNAP25). Η ανοσολογική ανοχή του OM-MOG περιλαμβάνει την άμεση αύξηση της παραγωγής PD-L1 και IL-10 και την αυξημένη έκφραση δεικτών που σχετίζονται με την εναλλακτική ενεργοποίηση, από τα μυελοειδή κύτταρα, (Ym1 που κωδικοποιεί την chitinase 3 like 3/CHI3L3), στα δευτερογενή λεμφικά όργανα, χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την επαγωγή της τύπου 2 μυελοειδούς απόκρισης.Για να διερευνήσουμε την κυτταρική βάση της ανοχής, μελετήσαμε την εμπλοκή των δύο ανώριμων πληθυσμών μυελοειδών κυττάρων με φαινότυπο CD11b+Ly6G (Ly6G) και CD11b+Ly6Chi (Ly6Chi) στην ΠΑΕ, οι οποίοι μαζί με τα Τ κύτταρα είναι απαραίτητοι για την επαγωγή της ΠΑΕ, αλλά μπορούν επίσης να μεσολαβούν την ανοσολογική ανοχή ως μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSC). Τα ανώριμα Ly6Chi κύτταρα που εκφράζουν τον υποδοχέα CCR2, είναι γνωστό πως είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη της ΠΑΕ. Μεταναστεύουν από την περιφέρεια στο ΚΝΣ, όπου ωριμάζουν και εκδηλώνουν τις παθογενετικές τους δράσεις. Η θεραπευτική χορήγηση του OM-MOG επάγει την ανοχή με την περιφερική ωρίμανση των Ly6ChiCCR2+ σε Ly6ChiMHCII+PD-L1+ κύτταρα, πριν τη μετανάστευση τους στο ΚΝΣ, η οποία επαρκεί για να αναστείλει την φλεγμονή και την απομυελίνωση του νωτιαίου μυελού στην ΠΑΕ. Το διαλυτό OM-MOG, που χορηγείται ενδοδερμικά, διοχετεύεται στον πλησιέστερο λεμφαδένα του δέρματος, όπου προσλαμβάνεται από τα υποκαψικά CD169+ μακροφάγα, και ενεργοποιεί τα Ly6ChiCCR2+ μονοκύτταρα να παράγουν MHCII και PD-L1. Έτσι εμποδίσει την συσσώρευση ανοσοκυττάρων στον νωτιαίο μυελό και καταπολεμά τις ήδη υπάρχουσες βλάβες. Για να μελετήσουμε τη μοριακή βάση του μηχανισμού ανοχής, δείξαμε πως το PD-L1 είναι απαραίτητος μεσολαβητής της ανοσολογικής ανοχής με τη χρήση εξουδετερωτικού αντισώματος έναντι του PD-L1 in vivo. Επιπλέον πειράματα με διαγονιδιακούς ποντικούς με ειδική διαγραφή του PD-L1 στα δενδριτικά κύτταρα, απέκλεισαν τα δενδριτικά κύτταρα ως απαραίτητη πηγή PD-L1 για την ανοσολογική ανοχή. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν πως η ωρίμανση των κυκλοφορούντων Ly6ChiCCR2+ μονοκυττάρων από τα ΟΜ-πεπτίδια μυελίνης αποτελεί έναν νέο μηχανισμό περιφερικής αντιγονοειδικής ανοσολογικής ανοχής, που αναστέλλει την ΠΑΕ, και επομένως αποτελεί υποσχόμενη στρατηγική για τον σχεδιασμό θεραπειών κατά των αυτοάνοσων ασθενειών, με γνωστά αυτοαντιγόνα.