Μελέτη της εκδήλωσης αγχώδους συμπεριφοράς σε ζωικό μοντέλο Πάρκινσον: διερεύνηση των νευροχημικών μηχανισμών στο μεταιχμιακό σύστημα του εγκεφάλου σε συνδυασμό με τη νευροπροστατευτική δράση φυσικών φαινολικών συστατικών

Abstract

Neurodegenerative diseases, whether hereditary or sporadic, are characterized by progressive nervous system dysfunction associated with atrophy of brain regions of the limbic system. PD is one of the most common neurodegenerative diseases of the CNS with a chronic and progressive course of motor disorders, which in recent years has been associated with emotional and cognitive disorders. Particularly, a high comorbidity of mood depression and anxiety disorders, with motor dysfunction in PD patients suggests a common neurobiological background. Neurochemical mechanisms responsible for non-motor, cognitive and emotional disturbances in PD have been associated with alterations of neurotransmitter systems such as that of serotonin and noradrenaline. It is also suggested that both the inflammatory etiology of PD and allostatic expression of neurotrophic factors are involved in the manifestation of anxiety disorders following degeneration of dopaminergic nigrostriatal neurons in PD. Since the existing pharmacological inteventions do not provide long-term management of PD non-motor symptoms the role of dietary protective phytochemicals hasbeen investigated in order to understand the mechanisms of the possible neuroprotective effect of supplementary diet rich in phenolic components, such as Corinthian currant (Vitis vinifera L. var Apyrena). Polyphenols are a group of phytochemicals that exhibit a multitude of beneficial health effects. Among others, grape seeds containing a mixture of polyphenolic flavonoids, are associated with a wide range of biological functions, including anti-inflammatory, anti-mutagenic, anti-carcinogenic and anti-apoptotic events. Simple phenolic compounds and flavonoids such as quercetin, kaempferol, resveratrol and 3-O-glycosides of anthocyanidins have been identified in Corinthian currant.In order to investigate the neurobiological mechanisms underlying the manifestation of non-motor impairments in PD as well as the possible neuroprotective role of polyphenols, we used a neurotoxic-rotenone rat model to produce a PD-like phenotype. To this end, adult male Wistar rats were used and randomly divided into four groups. Rotenone was injected subcutaneously (s.c.) at a volume of 2.5mg/kg of body weight daily for 28 days. The intervention groups were on a supplemental diet with Corinthian currant, which was not received by the respective control groups. Motor activity is a behavioral pattern that was associated with the phenotype of dopaminergic neuron degeneration. In addition, the manifestation of the anxiety-like phenotype was studied with Open Field (OFT) and Elevated Plus Maze (EPM) tests. Subsequently, neurochemical studies were conducted to correlate dopaminergic neuronal degeneration with noradrenergic and serotonergic transmission in brain regions involved in emotion control, specifically those of the limbic system, such as prefrontal and orbitofrontal cortex, hippocampus and amygdala. Markers of noradrenergic transduction, such as β2 adrenergic receptors and serotonergic transduction, with a focus on serotonin (5-HT) and serotonin transporter (SERT), were examined by immunohistochemistry, double immunofluorescence and Western blot methods. In parallel, in the context of glutaminergic transduction, changes in the expression levels of the NR2B (NMDAε2) subunit of the NMDA receptor and the postsynaptic protein PSD95 were investigated. Furthermore, the expression levels of the neurotrophic factor BDNF and the proinflammatory cytokine IL-1β were evaluated in the studied regions of the cortico-limbic circuit of rats treated with rotenone or vehicle with or without supplementation with Corinthian currant.According to the results of the present PhD thesis, dopaminergic dysfunction in the nigrostriatal pathway in a rotenone-induced rat model of PD was accompanied by an anxiety phenotype that was found to be associated with alterations in β2-ARs, 5-HT, SERT, BDNF and IL-1β in regions of the cortico-limbic system of the rat brain. In the present PhD thesis, supplementation with Corinthian currant partially restored motor as well as non-motor deficits. In a common context, supplementation with currants partially restored rotenone-induced changes in β2-ARs and partially rescued 5-HT+ and BDNF+ cell density. Thus, based on the hypothesis of this work, this thesis proposes changes in serotonergic transmission in the cortico-limbic circuit as possible pathophysiological neurochemical mechanisms in the manifestation of anxiety-induced affective disorders following degeneration of dopaminergic nigrostriatal neurons, and also highlights the possible specificity of "(poly)phenolic neuroprotection" in neural circuits controlling motor and anxiety-like impairments in a rat model of PD.

Οι νευροεκφυλιστικές παθήσεις, είτε κληρονομικές είτε σποραδικές, χαρακτηρίζονται από προοδευτική δυσλειτουργία του νευρικού συστήματος που σχετίζεται με ατροφία εγκεφαλικών περιοχών του μεταχμιακού συστήματος. Η νόσος του Πάρκινσον (PD) αποτελεί μία από τις πιο συχνές νευροεκφυλιστικές παθήσεις του Κ.Ν.Σ με χρόνια και προοδευτικά εξελισσόμενη πορεία κινητικών διαταραχών, που τα τελευταία χρόνια συσχετίζεται με συναισθηματικές και γνωσιακές διαταραχές. Οι διαταραχές της διάθεσης και ιδιαίτερα η κατάθλιψη καθώς και οι αγχώδεις διαταραχές αποτελούν συχνή συν-νοσηρότητα των ασθενών με PD, προτείνοντας ένα κοινό νευροανατομικό υπόβαθρο στο φλοίο-μεταιχμιακό σύστημα. Νευροχημικοί μηχανισμοί που ευθύνονται για τις μη-κινητικές διαταραχές, τις νοητικές και συναισθηματικές λειτουργίες στην PD έχουν συσχετισθεί με μεταβολές νευροδιαβιβαστικών συστημάτων όπως είναι αυτό της σεροτονίνης και της νοραδρεναλίνης. Επίσης, προτείνεται ότι τόσο η φλεγμονώδης αιτιολογία της PD αλλά και η αλλοστατική έκφραση νευροτροφικών παραγόντων εμπλέκονται στην εκδήλωση αγχωδών διαταραχών έπειτα από εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλανας ουσίας. Η υπάρχουσα φαρμακευτική αγωγή δεν παρέχει μακροχρόνια αποτελεσματική διαχείρηση των συμπτωμάτων της νόσου και τα τελευταία χρόνια έχει αναδειχθεί η διατροφική αξία φυτοχημικών ουσιών προκειμένου να κατανοηθούν οι μηχανισμοί της πιθανής νευροπροστατευτικής επίδρασης της συμπληρωματικής διατροφής που είναι πλούσια σε φαινολικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένης της Κορινθιακής σταφίδας (Vitis vinifera L. var Apyrena). Οι πολυφαινόλες που αποτελούν ομάδα φυτοχημικών παρουσιάζουν πληθώρα ευεργετικών δράσεων για την υγεία. Μεταξύ άλλων επιδεικνύουν αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αγγειοδιασταλτικές και αντιθρομβωτικές ιδιότητες. Συγκεκριμενα στην Κορινθιακή σταφίδα έχουν ταυτοποιηθεί απλές φαινολικές ενώσεις και φλαβονοειδή όπως κερκετίνη, καμπφερόλη, ρεσβερατρόλη και 3-Ο-γλυκοζίτες ανθοκυανιδινών.Στο πλαίσιο της παρούσας Διατριβής, ερευνητικό ερώτημα αποτέλεσαν οι νευροχημικές μεταβολές, ο ρόλος προ-φλεγμονωδών παραγόντων καθώς και η κατανόηση των μηχανισμών της πιθανής νευροπροστατευτικής δράσης της συμπληρωματικής διατροφής πλούσιας σε φαινολικά συστατικά, όπως η Κορινθιακή σταφίδα (Vitis vinifera L. var Apyrena). Για τη διερεύνηση των νευροβιολογικών μηχανισμών που υπογραμμίζουν την εκδήλωση μη-κινητικών διαταραχών στην PD καθώς και τον ρόλο των πολυφαινολών χρησιμοποιήθηκαν ως ζωικό πρότυπο αρσενικοί ενήλικοι Wistar επίμυες. Το ζωικό μοντέλο της PD αναπτύχθηκε σε πειραματικές ομάδες που έλαβαν υποδόρια ενέσεις της νευροτοξίνης ροτενόνη για 28 ημέρες σε συγκέντρωση 2,5 mg/kg. Οι ομάδες παρέμβασης έλαβαν συμπληρωματική διατροφή με Κορινθιακή σταφίδα, ενώ υπήρχαν και οι αντίστοιχες ομάδες ελέγχου (με έκδοχο νευροτοξίνης και ροτενόνης-ζώων) χωρίς την διατροφική παρέμβαση. Η κινητική συμπεριφορά καθώς και η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων χαρακτήρισε τον φαινότυπο που ομοιάζει με PD. Στην παρούσα μελέτη επιπλέον διερευνήθηκε η εκδήλωση αγχώδους συμπεριφοράς με δοκιμασίες ανοιχτού πεδίου (Open Field) και υπερυψωμένου λαβυρίνθου σχήματος «+» (Elevated Plus Maze). Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν νευροχημικές μελέτες με στόχο τον συσχετισμό της εκφύλισης των ντοπαμινεργικών νευρώνων με τη νοραδρενεργική και σεροτονινεργική διαβίβαση σε εγκεφαλικές περιοχές που εμπλέκονται στον έλεγχο συναισθημάτων και συγκεκριμένα σε αυτές του μεταιχμιακού συστήματος, όπως ο προμετωπιαίος και ο κογχομετωπιαίος φλοιός, ο ιππόκαμπος και ο βασικός και έξω αμυγδαλοειδής πυρήνας. Εξετάστηκαν δείκτες της νοραδρενεργικής διαβίβασης, όπως οι β2 αδρενεργικοί υποδοχείς και της σεροτονεργικής διαβίβασης με επίκεντρο την σεροτονίνη (5-ΗΤ) και τον μεταφορέα της σεροτονίνης (SERT), με μεθόδους ανοσοϊστοχημείας, διπλού ανοσοφθορισμού και Western Blot. Παράλληλα, στα πλαίσια της γλουταμινεργικής διαβίβασης, διερευνήθηκε η αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης της NR2B (NMDAε2) υπομονάδας του NMDA υποδοχέα και της μετασυναπτικής πρωτεΐνης PSD95. Σε επόμενο στάδιο πραγματοποιήθηκε μελέτη των επιπέδων έκφρασης του νευροτροφικού παράγοντα BDNF και της προφλεγμονώδους κυτοκίνης IL-1β στις υπό μελέτη περιοχές του φλοιο-μεταιχμιακού κυκλώματος επίμυων που έλαβαν ροτενόνη ή έκδοχο με ή χωρίς συμπληρωματική διατροφή με Κορινθιακή σταφίδα.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας Διατριβής, η ντοπαμινεργική δυσλειτουργία στη μελαινοραβδωτή οδό σε πειραματικό ζωικό μοντέλο ροτενόνης συνοδεύτηκε από αγχώδη φαινότυπο που διαπιστώθηκε ότι σχετίζεται με μεταβολές στους β2-ARs, την 5-ΗΤ, τον SERT, τον BDNF και την IL-1β σε περιοχές του φλοιο-μεταιχμιακού συστήματος εγκεφάλου επίμυος. Στην παρούσα μελέτη, η συμπληρωματική διατροφή με Κορινθιακή σταφίδα αποκατέστησε εν μέρει τα κινητικά καθώς επίσης και τα μη κινητικά ελλείμματα. Σε κοινό πλαίσιο, η συμπληρωματική διατροφή με Κορινθιακή σταφίδα αποκατέστησε εν μέρει τις επαγόμενες από τη ροτενόνη αλλαγές στους β2-ARs και διέσωσε εν μέρει την πυκνότητα των κυττάρων 5-ΗΤ+ και BDNF+. Συνολικά με βάση την υπόθεση της εργασίας, της παρούσας Διατριβής προτείνονται ως πιθανοί παθοφυσιολογικοί νευροχημικοί μηχανισμοί στην εκδήλωση αγχωδών συναισθηματικών διαταραχών οι μεταβολές στη σεροτονινεργική διαβίβαση στο φλοίο-μεταιχμικό κύκλωμα και επίσης αναδεικνύεται η μερική «(πολυ)φαινολική νευροπροστασία» σε νευρικά κυκλώματα που ελέγχουν κινητικές και συναισθηματικές λειτουργίες.