Triage biodosimetry and mechanistic insights into chromosomal aberration formation and chromothripsis for risk assessment following exposure to radiation of different qualities

Abstract

Human exposure to ionizing radiation, due to its extensive use in medical and industrial applications, may result in diverse biological effects depending on the radiation quality, absorbed dose and dose rate. In addition, accidental radiological exposure in the event of a major incident or act of nuclear terrorism can cause serious health effects to hundreds or thousands of people. Consequently, for mass-casualty medical management, there is a critical need for the development of suitable biomarkers of exposure that could enable high-throughput biodosimetry, in order to obtain individualized dose estimates. Moreover, the evaluation of the associated health consequences of an exposure could be greatly facilitated by the elucidation of the mechanisms underlying the biological action of different radiation qualities, as well as the genetic predisposition to radiation-induced adverse effects. In the present doctoral thesis, all the above issues have been thoroughly examined. The research efforts have been focused on the prompt estimation of individualized absorbed dose, using cytogenetic endpoints, and on the assessment of the associated health risk based on the understanding of the mechanisms underlying genomic instability, following exposure to radiation of different qualities. Specifically, among the biomarkers of radiation exposure, we selected chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes that can be visualized and analyzed by means of the cell-fusion-mediated premature chromosome condensation (PCC). Improving on this assay, we have developed the rapid and minimally invasive micro-PCC assay that has the potential to automate absorbed dose estimation in large-scale radiological emergencies, since it requires only 100μl of blood and can be performed in 96-well plates. Furthermore, we have explored the advantages of applying DNA probes and the multicolor fluorescence in situ hybridization (mFISH) technique to prematurely condensed chromosomes, for the analysis of chromosomal rearrangements and the identification of predictive biomarkers for early and late health effects. Additionally, emphasis has been given to the elucidation of the mechanisms underlying the formation of chromosome aberrations by different radiation qualities and the phenomenon of chromothripsis, which has been proposed as an alternative mutational process driving carcinogenesis. Using cytogenetic endpoints, we have provided, for the first time, experimental evidence for the induction of PCC in micronuclei as the mechanistic origin of chromothripsis. Moreover, we have demonstrated, for the first time, that high linear energy transfer (LET) radiation can induce localized chromosome shattering, which we have proposed as a fingerprint of exposure to high-LET radiation. This observation is considered of great significance, since localized chromosome shattering may lead to chromothripsis, resulting in chromosomal and genomic instability, and potentially carcinogenesis. Finally, for the individualized assessment of intrinsic radiosensitivity, we have developed an enhanced G2-assay, which is expected to contribute substantially to radiation protection, personalized radiotherapy, as well as to the safety of personnel related to space exploration.

Η έκθεση του ανθρώπου στην ιοντίζουσα ακτινοβολία, λόγω της ευρείας χρήσης της σε ιατρικές και βιομηχανικές εφαρμογές, μπορεί να οδηγήσει σε ποικίλες βιολογικές επιπτώσεις ανάλογα με την ποιότητα της ακτινοβολίας, την απορροφούμενη δόση και τον ρυθμό δόσης. Επιπλέον, η έκθεση σε ακτινοβολία σε περίπτωση μεγάλου ατυχήματος ή πυρηνικής τρομοκρατικής ενέργειας μπορεί να προκαλέσει σοβαρές επιπτώσεις στην υγεία εκατοντάδων ή ακόμη και χιλιάδων ανθρώπων. Συνεπώς, για την διαχείριση ατυχημάτων μεγάλης κλίμακας, κρίνεται αναγκαία η ανάπτυξη κατάλληλων βιοδεικτών έκθεσης που θα μπορούσαν να επιτρέψουν τη βιοδοσιμετρία υψηλής απόδοσης, προκειμένου να ληφθούν εξατομικευμένες εκτιμήσεις δόσης. Επιπλέον, η αξιολόγηση των σχετικών επιπτώσεων μιας έκθεσης στην υγεία θα μπορούσε να διευκολυνθεί σημαντικά από την αποσαφήνιση των μηχανισμών που διέπουν τη βιολογική δράση ακτινοβολιών διαφορετικών ποιοτήτων, καθώς και τη γενετική προδιάθεση για δυσμενείς επιπτώσεις που προκαλούνται από την ακτινοβολία. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή έχουν εξεταστεί διεξοδικά όλα τα παραπάνω θέματα. Οι ερευνητικές προσπάθειες επικεντρώθηκαν στην έγκαιρη εκτίμηση της εξατομικευμένης απορροφούμενης δόσης, χρησιμοποιώντας κυτταρογενετικούς βιοδείκτες, και στην αξιολόγηση του σχετικού κινδύνου για την υγεία με βάση την κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν τη γονιδιωματική αστάθεια, μετά από έκθεση σε ακτινοβολίες διαφορετικών ποιοτήτων. Συγκεκριμένα, μεταξύ των βιοδεικτών έκθεσης σε ακτινοβολία, επιλέξαμε τις χρωμοσωμικές ανωμαλίες στα λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος οι οποίες μπορούν να απεικονιστούν και να αναλυθούν μέσω της πρόωρης χρωμοσωμικής συμπύκνωσης (PCC) που πραγματοποιείται με κυτταρικές συντήξεις. Βελτιώνοντας τη μέθοδο αυτή, αναπτύξαμε την ταχεία και ελάχιστα επεμβατική μέθοδο micro-PCC που έχει τη δυνατότητα να αυτοματοποιήσει την εκτίμηση απορροφούμενης δόσης σε μεγάλης κλίμακας ραδιολογικές καταστάσεις έκτακτης ανάγκης, καθώς απαιτεί μόνο 100 μl αίματος και μπορεί να εκτελεστεί σε τρυβλία 96 κοιλοτήτων. Επιπλέον, διερευνήσαμε τα πλεονεκτήματα της εφαρμογής ανιχνευτών DNA και της τεχνικής πολύχρωμου in situ υβριδισμoύ φθορισμού (mFISH) σε πρόωρα συμπυκνωμένα χρωμοσώματα, για την ανάλυση των χρωμοσωμικών αναδιατάξεων και τη διερεύνηση προγνωστικών βιοδεικτών για άμεσες και απώτερες επιπτώσεις στην υγεία. Επιπρόσθετα, ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στη διαλεύκανση των μηχανισμών που διέπουν τον σχηματισμό χρωμοσωμικών ανωμαλιών από ακτινοβολίες διαφορετικών ποιοτήτων και το φαινόμενο της χρωμοθρύψης, το οποίο έχει προταθεί ως εναλλακτική οδός γονιδιωματικής αστάθειας και καρκινογένεσης. Χρησιμοποιώντας κυτταρογενετικούς βιοδείκτες, παρουσιάσαμε, για πρώτη φορά, πειραματικά δεδομένα για την επαγωγή PCC σε μικροπυρήνες ως τη μηχανιστική προέλευση της χρωμοθρύψης. Επιπλέον, τεκμηριώσαμε, για πρώτη φορά, πως η ακτινοβολία υψηλής γραμμικής μεταφοράς ενέργειας (high-LET) μπορεί να προκαλέσει τοπικό θρυμματισμό χρωμοσωμάτων, τον οποίο προτείναμε ως δακτυλικό αποτύπωμα έκθεσης σε ακτινοβολία high-LET. Αυτή η παρατήρηση είναι ιδιαίτερα σημαντική, καθώς ο τοπικός θρυμματισμός χρωμοσωμάτων μπορεί να οδηγήσει σε χρωμοθρύψη, με αποτέλεσμα την χρωμοσωμική και γονιδιωματική αστάθεια, και δυνητικά την καρκινογένεση. Τέλος, για την εξατομικευμένη αξιολόγηση της εγγενούς ακτινοευαισθησίας, αναπτύξαμε μια ενισχυμένη χρωμοσωμική μέθοδο G2 (enhanced G2-assay) η οποία αναμένεται να συμβάλει ουσιαστικά στην ακτινοπροστασία, στην εξατομικευμένη ακτινοθεραπεία, καθώς και στην ασφάλεια του προσωπικού που σχετίζεται με την εξερεύνηση του διαστήματος.