The role of important non-coding RNAs and related protein components in translation and transcription

Abstract

In less than a decade since the sequencing of the human genome, it has become clear that over 85% of the genome encodes RNA transcripts that do not translate into proteins. These transcripts are also known as non-coding RNAs (ncRNAs) and were previously divided into housekeeping and regulatory ncRNAs. Among the most prominent housekeeping examples of ncRNAs that we now known that exhibit essential regulatory roles are the transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nuclear RNAs (snRNAs), small nucleolar RNAs (snoRNAs), RNase P RNA, and telomerase RNA (Zhang et al., 2019). In addition, the ncRNA transcriptome has been recognized as a major regulome that includes microRNAs (miRNAs), long non-coding RNAs (lncRNAs), PiWi RNAs (piRNAs), tRNA-derived fragments (tRFs), vault RNAs etc., and controls crucial metabolic processes in the cell (Morris and Mattick, 2014; Schimmel, 2018; Lorenzi et al., 2021). Moreover, they have emerged as important biomarkers of homeostasis at the epigenetic, transcriptional, post-transcriptional and translational level (Schimmel, 2018; Slack and Chinnaiyan, 2019). Upon transcription, all ncRNAs undergo numerous maturation steps which are further mediated by important enzymes, ribonucleoprotein complexes or scaffold proteins of known or putative function, generally known as RNA binding proteins (RBPs). In many cases, the interactions between protein factors and ncRNAs can determine not only the function and the fate of an RNA molecule, but also can affect transcription and translation rates, overall. Elucidation of the role of ncRNAs-interacting proteins is critical to understand the hardcore biology and molecular functions of ncRNAs, to dissect the contribution of proteins in additional molecular functions and also to reveal the aspects of protein and ncRNAs in several human diseases and malignancies.Main objective of the present thesis was the study of the role of important RNA-binding protein subunits which participate in biogenesis of the tRNA molecules but could also additionally carry out alternative tasks in non-canonical functions. In the first part of the thesis, the role of La protein overexpression in cancer was examined as a global gatekeeper and abundance regulator of Pol III ncRNAs. La overexpression in lung adenocarcinoma cells lead to a significant increase in cell proliferation and motility. Next Generation sequencing (NGS) analysis showed the participation of La in translation and RNA metabolism. La accumulation affected the expression of mTORC2 complex and important tRNA maturation and translation initiation factors. In addition, upregulation of the tumorigenic tRF-1001 and its parent tRNASerUGA was also observed. Although the conserved LAM-RRM1 module is responsible for the RNA binding capacity of La, biochemical analysis showed that LAM motif alone can bind both oligo(U) and a pre-tRNA ligands. The biochemical, supported also by existing NMR-derived structural data, supports the La involvement in binding of diverse RNAs, that could account for a modulatory role of La in carcinogenesis. In the second part of the thesis, the CRISPR/Cas9 genome editing tool was used to knock-out each individual protein subunit of RNase P holoenzyme in HeLa cancer cell line. Given the current knowledge on moonlighting roles of the 10 RBPs that form the RNase P holoenzyme in human cells, the screening analysis showed that POP1 and RPP30 protein subunits are essential for cell viability while RPP25 is dispensable. The RPP25 deficient cells showed an increased proliferation and migration rate. In a next step, Next Generation sequencing (NGS) analysis showed that ablation of RPP25 regulates genes with significant role in cancer and steroid metabolism but also it is observed a deregulation of expression levels of long-intergenic RNAs and other non-coding RNAs that participate in cancer. Moreover, small RNA-seq showed that specific miRNAs, tRNAs and tRFs are deregulated enhancing the cancer progression. Subsequent, global analysis of translation rates confirmed the elevated translational levels. Finally, the edited cell lines were used for in vivo characterization of RPP25-GFP tagged localization using fluorescence microscopy to reveal possible alternative localizations of RPP25 that could imply alternative functions in RNA-mediated phase separation.Taken together, the current thesis attempted to provide a comprehensive picture of assembly, coordination, and heterogeneity of prominent RNA-binding proteins like La and RPP25, under various conditions and to identify pathways that regulate gene expression at the transcription and translation level, that could be further exploited for therapy.

Σε λιγότερο από μια δεκαετία από την αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος, κατέστη σαφές ότι περίπου το 85% του γονιδιώματος κωδικοποιεί RNA μόρια τα οποία δεν μεταφράζονται σε πρωτεΐνες. Τα μετάγραφα αυτά είναι γνωστά ως μη-κωδικά μόρια RNA (ncRNAs) και αντιπροσωπεύουν ένα δυναμικό μεταγράφωμα το οποίο περιλαμβάνει RNA που διατηρούν τη κυτταρική λειτουργία (housekeeping) όπως το μεταφορικό RNA (tRNA), το ριβοσωμικό RNA (rRNA), τα μικρά πυρηνικά RNAs (snRNAs), τα μικρά πυρηνικά RNAs (snoRNAs), το RNA της ριβονουκλεάσης P και το RNA της τελομεράσης (Zhang et al., 2019). Επιπλέον, το μεταγράφωμα αυτό περιλαμβλανει και ρυθμιστικά μόρια όπως τα microRNAs (miRNAs), τα μεγάλου μήκους μη κωδικά RNAs (long ncRNAs), τα PiWi RNAs (piRNAs), τα νέα θραύσματα των tRNAs (tRNA- derived RNA fragments; tRFs), τα vault RNAs και άλλα ncRNAs τα οποία συμμετέχουν και ελέγχουν διάφορες μεταβολικές διεργασίες στα κύτταρα (Morris and Mattick, 2014- Schimmel, 2018- Lorenzi et al., 2021). Όλα αυτά τα μη-κωδικά μόρια RNA έχουν αναδειχθεί ως σημαντικοί βιοδείκτες σε επιγενετικό, μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο (Schimmel, 2018; Slack and Chinnaiyan, 2019). Ωστόσο, κατά τη διάρκεια της μεταγραφής τους υφίστανται διάφορα στάδια ωρίμανσης, τα οποία διαμεσολαβούνται από σημαντικά ένζυμα, ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα ή ακόμα και από πρωτεΐνες-ικριώμα (scaffold proteins) γνωστές ως RNA-binding proteins (RBPs). Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ μορίων RNA και πρωτεϊνών καθορίζουν όχι μόνο τη λειτουργία και τη τύχη του RNA αλλά και τους ρυθμούς της μεταγραφής και μετάφρασης του κυττάρου. Η διερεύνηση του ρόλου αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τόσο τα ncRNAs όσο και τις αντίστοιχες πρωτεΐνες, καθώς επίσης για την αποσαφήνιση του πιθανού ρόλου τους στην εμφάνιση διαφόρων ασθενειών και νεοπλασιών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του ρόλου σημαντικών πρωτεϊνών που δεσμεύουν RNA μόρια και συμμετέχουν τόσο στη βιογένεση των tRNA μορίων, αλλά και σε επιπρόσθετες σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε ο ρόλος της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης La (Lupus antigen) στον καρκίνο. Η υπερέκφραση της La πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα και οδήγησε σε σημαντική αύξηση του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων ενώ πειράματα αλληλουχισης νέας γενιάς (NGS) έδειξαν τη συμμετοχή της La στη μετάφραση και στο μεταβολισμό του RNA. Επιπρόσθετα, η συσσώρευση της La επηρέασε την έκφραση του συμπλόκου mTORC2 καθώς και σημαντικών παραγόντων που συμμετέχουν στην ωρίμανση του tRNA αλλά και στην έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του tRF-1001 και του tRNASerUGA. Τέλος, μελετήθηκε η ικανότητα δέσμευσης του μοτίβου LAM, το οποίο έχει βρεθεί ότι παρουσία του RRM1 (LAM-RRM1) είναι υπέυθυνο για τη δέσμευση του RNA. Η βιοχημική μελέτη έδειξε ότι το μοτίβο LAM μόνο του, μπορεί να δεσμεύσει τόσο oligo(U) RNA όσο και πρόδρομα μετάγραφα tRNAs κάτι που επιβεβαιώνεται και από τα υπάρχοντα δομικά δεδομένα (NMR). Η ιδιότητα αυτή του μοτίβου LAM θα μπορούσε να εξηγήσει τη συμμετοχή της La στη δέσμευση μιας ποικιλίας RNAs και το ρυθμιστικό ρόλο της στην καρκινογένεση.Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής, χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR/Cas9 για την απαλοιφή κάθε επιμέρους πρωτεϊνικής υπομονάδας του ολοενζύμου RNase P στη καρκινική κυτταρική σειρά ΗeLa. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πρωτεϊνικές υπομονάδες POP1 και RPP30 είναι απαραίτητες για τη βιωσιμότητα των κυττάρων, σε αντίθεση με τη πρωτεϊνική υπομονάδα RPP25. Τα κύτταρα που δεν παρήγαγαν τη πρωτεΐνη RPP25 έδειξαν αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης τους. Πειράματα αλληλούχισης νέας γενιάς (NGS) στο μεταγράφωμα των κυττάρων έδειξαν ότι η RPP25 συμμετέχει στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό των στεροειδών, ενώ επίσης παρατηρήθηκε απορρύθμιση των επιπέδων έκφρασης διαφόρων μη κωδικών RNAs που συμμετέχουν στον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων και των long-intergenic RNAs. Επιπλέον, αλληλούχιση νέας γενιάς των μικρών RNAs έδειξε ότι συγκεκριμένα miRNAs, tRNAs και tRFs απορρυθμίστηκαν ενισχύοντας τα παραπάνω αποτελέσματα για τη συμμετοχή της RPP25 στον καρκίνο. Στη συνέχεια, απουσία της RPP25 παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα μετάφρασης. Τέλος, η ανασυνδυασμένη RPP25 σε σύντηξη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) εκφράστηκε στην επεξεργασμένη κυτταρική σειρά για μελέτη του υποκυττάριου εντοπισμού της και τη διερεύνηση της πιθανής συμμετοχής της στο διαχωρισμό φάσεων με τη μεσολάβηση RNA (RNA-phase separation). Συνοψίζοντας, στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να αναδείξει μια ολοκληρωμένη εικόνα της συναρμολόγησης, του συντονισμού και της ετερογένειας σημαντικών RBPs, όπως η La και η RPP25, υπό διαφορετικές συνθήκες και να προσδιορίσει μονοπάτια που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση σε επίπεδο μεταγραφής και μετάφρασης, τα οποία θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν περαιτέρω για θεραπευτικούς σκοπούς.