An in-silico approach for predicting and characterizing interactomes among bacterial genes and host microRNAs

Abstract

The study of metagenomics has offered us novel aspects of the world around us and within, while Shotgun sequencing revolutionized the field, offering higher throughput and resolution. With the term Microbiome we refer to the entirety of microorganisms (i.e., Bacteria, Yeast, Archaea, Viruses) present in a given environment, as well as to their associated function(s). Next-Generation Sequencing (NGS) techniques have shed light to the complex host-microbiome relationships in humans, mice and other organisms, enabling detailed, and even population-scale studies. The Human Microbiome Project and other similar scientific endeavors revealed the importance of the microbiome and its implications in pathological conditions, including GI tract inflammatory diseases, neoplastic conditions, metabolic disorders and neurodegenerative diseases.microRNAs (miRNAs) are short RNA molecules (~22 nucleotides long) which exert their post-transcriptional regulatory function by targeting miRNA Recognition Elements (MREs) on the sequence of coding and non-coding RNAs (e.g. messenger RNAs, mRNAs, long non-coding RNAs, lncRNAs). miRNA-MRE binding follows complex rules of perfect or imperfect RNA complementarity and results in translational suppression and/or degradation of the targeted transcripts. The vast majority of biological processes in higher mammals are under miRNA regulation at the post-transcriptional level.The Microbiome regulates host gene expression but the underlying molecular mechanisms of this interplay remain unclear. Recently, the regulation by miRNAs has emerged as both a critical component of the host’s response to infections and as a strategy exploited by microorganisms to manipulate host molecular pathways. Recent studies show that host miRNAs can enter microbial cells and regulate their gene expression and critical processes such as growth rates.During the course of my PhD thesis, a computational method for the analysis of metagenomics datasets derived from NGS techniques was designed and implemented. The methodology utilizes a series of algorithmic techniques and data structures to quantify microbial abundances in Shotgun metagenomics datasets with dramatically reduced memory footprints, lightning-fast speed and accuracy that goes beyond the state-of-the-art. On top of the quantification results, a user-friendly graphical interface offers numerous downstream analyses modules, enabling users to explore and visualize microbial abundances but also conduct analyses of differential abundance, diversity indices and correlation. Moreover, a database hosting experimentally supported microbe-disease associations was developed. The database is comprised of more than7900 associations, linking 43 diseases and 1396 microorganisms. Finally, NGS-derived samples (i.e., Shotgun metagenomics, small RNA-Seq) were analyzed and a computational methodology was developed in order to extract possible targets of human miRNAs in genes of the host’s Microbiome. For the needs of the study, general biochemical and biophysical rules of the RNA-RNA interaction space were utilized, including target sequence accessibility, dimer binding energy and sequence complementarity (i.e., matches and mis-matches in the miRNA binding region).During my doctoral dissertation, I participated in 8 published studies (i.e., one presentation of a microbial quantification application in Shotgun metagenomics samples, two studies related to miRNA targeting, the showcase of a database of experimentally supported microbe-disease associations, one transcriptomic analyses for the study of the tumor microenvironment using single-cell RNA Sequencing, one transcriptomic study to investigate FLASH radiation for the treatment of tumors, one transcriptomic study to investigate Host-Leishmania interactions and the showcase of a database providing circulating miRNAs of diagnostic/prognostic value). I presented research results in 6 scientific conferences (4 national and 2 international) and contributed to the organization of the European Conference of Computational Biology (ECCB 2018). As of today, my publications have been cited 841 times, according to Google Scholar.

Η επιστήμη της Μεταγονιδιωματικής έχει προσφέρει τα τελευταία χρόνια σημαντικές δυνατότητες προς τη μελέτη των μικροοργανισμών (Βακτήρια, Αρχαία, Μύκητες, Ιοί) σε περίπλοκα περιβαλλοντικά δείγματα όπως είναι το νερό ωκεανών, το χώμα αλλά και το ανθρώπινο σώμα. Με τον όρο Μικροβίωμα χαρακτηρίζεται το σύνολο των μικροοργανισμών που εποικίζουν ένα περιβάλλον, καθώς επίσης και οι λειτουργίες που επιτελούν σε αυτό. Οι τεχνικές Αλληλούχησης Επόμενης Γενιάς (π.χ., Shotgun metagenomics) έχουν παίξει καθοριστικό ρόλο στη μελέτη των περίπλοκων αλληλεπιδράσεων μεταξύ Ξενιστή-Μικροβιώματος στον άνθρωπο και σε άλλους οργανισμούς. Το Human Microbiome Project και παρόμοιες μελέτες μεγάλης κλίμακας των τελευταίων ετών, αποκάλυψαν τη σημασία του Μικροβιώματος και τη συμμετοχή του σε παθολογικές καταστάσεις συμπεριλαμβανομένων των φλεγμονωδών νόσων του εντέρου, νεοπλασματικών παθήσεων, μεταβολικών διαταραχών, νευροεκφυλιστικών ασθενειών και άλλων παθήσεων.Τα microRNAs (miRNAs) αποτελούν μη-κωδικά μετάγραφα μήκους ~22 νουκλεοτιδίων. Είναι κύριοι μετα-μεταγραφικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης με καθοριστικό ρόλο σε πολυάριθμες φυσιολογικές αλλά και παθολογικές καταστάσεις. Τα miRNAs προσδένουν σε μικρές ακολουθίες των στόχων τους που ονομάζονται Στοιχεία Αναγνώρισης από miRNAs (miRNA Recognition Elements, MREs). Κατά τη στόχευση, τα miRNAs προσδένονται στα MREs, με βάση σύνθετους κανόνες τέλειας ή ατελούς συμπληρωματικότητας του RNA, επάγοντας την καταστολή της μετάφρασης ή και την αποικοδόμησή του. Η πλειοψηφία των βιολογικών διεργασιών στα ανώτερα θηλαστικά ρυθμίζεται από τη δράση των miRNAs σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο.Το Μικροβίωμα διαμορφώνει τη γονιδιακή έκφραση του ξενιστή, αλλά οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί της αλληλεπίδρασης αυτής παραμένουν ασαφείς. Προσφάτως έχει αναδειχθεί η ρύθμιση της έκφρασης των miRNAs αφενός ως κρίσιμο συστατικό της απόκρισης του ξενιστή σε μολύνσεις, αφετέρου δε ως στρατηγική που εκμεταλλεύονται οι μικροοργανισμοί για να χειραγωγήσουν μοριακά μονοπάτια του ξενιστή. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν πως miRNAs του ξενιστή δύνανται να εισχωρήσουν σε μικροβιακούς οργανισμούς, επηρεάζοντας τη γονιδιακή τους έκφραση και κρίσιμες διεργασίες τους όπως το ρυθμό αύξησης.Στα πλαίσια της παρούσας Διατριβής, αναπτύχθηκε υπολογιστική μεθοδολογία για την ανάλυση δεδομένων Μεταγονιδιωματικής από πειράματα Αλληλούχησης Επόμενης Γενιάς. Η εν λόγω μεθοδολογία χρησιμοποιεί μία σειρά από αλγοριθμικές τεχνικές και δομές δεδομένων με σκοπό την ποσοτικοποίηση μικροοργανισμών σε δείγματα Shotgun metagenomics με δραματικά μειωμένες απαιτήσεις σε μνήμη RAM, εξαιρετικά υψηλή ταχύτητα και ακρίβεια που ξεπερνάει το state-of-the-art. Ταυτόχρονα, αναπτύχθηκε γραφικό περιβάλλον μέσω του οποίου προσφέρονται μία σειρά από στατιστικές αναλύσεις και επιλογές οπτικοποίησης για τα δεδομένα ποσοτικοποίησης που προέκυψαν από τα αναλυμένα δείγματα. Επίσης, σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε βάση δεδομένων που περιέχει πειραματικά υποστηριζόμενες συσχετίσεις μεταξύ βακτηρίων και ασθενειών. Η βάση δεδομένων περιέχει περισσότερες από 7900 συσχετίσεις, που αφορούν 43 ασθένειες και 1396 μικροοργανισμούς. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση δειγμάτων NGS (Shotgun metagenomics, small RNA-Seq) και αναπτύχθηκε υπολογιστική μεθοδολογία με σκοπό την εξαγωγή πιθανών στόχων των ανθρώπινων miRNAs σε γονίδια του Μικροβιώματός του. Για τις ανάγκες της μελέτης, έγινε χρήση βιοφυσικών και βιοχημικών κανόνων γενικής φύσεως που ισχύουν για τις RNA-RNA αλληλεπιδράσεις, όπως η προσβασιμότητα ακολουθίας-στόχου, η ενέργεια πρόσδεσης για τη δημιουργία του διμερούς και συνολικός αριθμός ταιριασμάτων και αναντιστοιχιών στην περιοχή πρόσδεσης.Κατά την εκπόνηση της Διδακτορικής μου Διατριβής, συμμετείχα σε 8 δημοσιευμένες εργασίες σε επιστημονικά περιοδικά υψηλού κύρους (μία παρουσίαση μεθοδολογίας ποσοτικοποίησης μικροοργανισμών, δύο εργασίες σχετικές με τη μελέτη της στόχευσης mRNAs/lncRNAs από miRNAs, μία παρουσίαση Βάσης Δεδομένων με συσχετίσεις της αφθονίας μικροβίων με ασθένειες, μία μεταγραφωματική μελέτη για τη διερεύνηση του μικροπεριβάλλοντος του καρκίνου με τεχνικές single-cell RNA-Seq, μία μεταγραφωματική μελέτη για τη διερεύνηση της τεχνικής ακτινοβόλησης όγκων FLASH, μία μεταγραφωματική μελέτη για τη διερεύνηση αλληλεπιδράσεων μεταξύ Ξενιστή-Λεϊσμάνιας και μία παρουσίαση Βάσης Δεδομένων με miRNAs διαγνωστικής/προγνωστικής αξίας). Έχω παρουσιάσει ερευνητικά αποτελέσματα σε 6 επιστημονικά συνέδρια και ημερίδες (4 εθνικά, 2 διεθνή), και έχω συμβάλει στη διοργάνωση του Πανευρωπαϊκού Συνεδρίου Βιοπληροφορικής ECCB 2018. Σύμφωνα με το Google Scholar οι εργασίες στις οποίες μετέχω έχουν λάβει μέχρι σήμερα 841 αναφορές.