The role of megakaryocytes in controlling bone development in primary myelofibrosis

Abstract

Changes in bone homeostasis and development in states of myeloproliferative neoplasms (MPNs) are complex. Continued research is needed to elucidate mechanisms that govern such changes. In the current Ph.D. dissertation, I focused on primary myelofibrosis (PMF), a form of MPN that is characterized by excess proliferation of megakaryocytes (MKs) and bone marrow (BM) fibrosis. Osteosclerosis has been reported as a serious complication of some MPNs. Although osteosclerosis contributes to BM failure, and is associated with severe joint and bone pain, its manifestation and etiology in PMF have remained elusive. The increased number of MKs could be involved in bone changes since MKs have been reported to influence bone cells differentiation. Several investigations point to increased bone volume in PMF, but comparison according to sex differences has not been fully performed. In Aims 1 and 2 of our study, we used a humanized transgenic mouse model of PMF carrying the most common mutation associated with this disease, namely the human JAK2V617F hyper-activating mutation, under the control of the Vav promoter. These mice were used to study influences of the mutation on bone density and strength in the two sexes (Aim 1 of the dissertation). Overall, micro-computed tomography (micro-CT) revealed significant phenotypes in both males and females, but the effect of the mutation seemed to have opposite effects on trabecular bone in the two sexes. It increased trabecular bone volume in females, while decreasing it in males, as compared to matching controls. At the femur mid-shaft, the transgenic male mice had much greater porosity and lower mineral density and cortical thickness, compared to controls. There were also trends towards JAK2V617F male mice having lower moments of inertias, which is one of the main indicators of bending strength. For this reason, we proceeded to mechanical testing (three-point bending), and observed that male JAK2V617F mice had similar or slightly inferior bone mechanical properties relative to their controls. Based on the micro-CT and three-point bending results, we next assessed the bones at tissue level to examine differences in the mineralization process. This analysis revealed the presence of more osteoid in tissues from JAK2V617F male mice compared to controls, which is the unmineralized organic portion of the bone matrix that is formed prior to the maturation of bone tissue. This indicated that the mineralization process is hampered in male JAK2V617F mice. The next step (Aim 2 of the dissertation) was to investigate how MKs derived from male mice that bear the JAK2V617F mutation influence the differentiation of osteoblasts (OBs) that are responsible for the mineralization process. This was carried out with bone marrow Mesenchymal Stem Cells (MSC)-MK co-cultures, using MKs from male mice and culture conditions that promote OB differentiation (therefore, referred to also as an OB-MK co-culture). The presence of JAK2V617F MKs and/or their conditioned medium significantly decreased OB differentiation. In search for possible candidates responsible for the effect of JAK2V617F mutated MKs on osteogenesis, we used a mouse mRNA osteogenesis array, and several transcripts were identified as differentially expressed between the mutated MKs and control ones. There was increased expression of Noggin, Chordin, Alpha-2-HS-glycoprotein, Collagen type IV alpha 1 and Collagen type XIV alpha 1 (mostly known to inhibit bone differentiation), and decreased expression of Alkaline phosphatase, Vascular cell adhesion molecule 1, Sclerostin, Distal-less homeobox 5 and Collagen type III alpha 1 (associated with osteogenesis) in JAK2V617F MKs from male mice, compared to controls. For each gene or protein differentially displayed in JAK2V617F mutated MKs compared to controls, we contemplated cause-and-effect studies to examine their contribution to the inhibitory effect of male MKs on OB differentiation. Yet, it became apparent that the mutated MKs undergo a change in global gene programming involving several pathways linked to inhibition of osteogenesis. Hence, we propose that a cluster of such changes, and not a single one, is promoting the inhibition observed in OB differentiation by mutated MKs. Contrary to the observation in male JAK2V617F mice, micro-CT analysis of mutated female mice showed greater bone volume relative to control mice. Based on mechanical testing analysis it was concluded that this mutation-acquired phenotype is likely due to differences in bone geometry and not differences in the intrinsic material properties of the bone. This suggested that in females there are no detrimental effects of JAK2V617F expression on either whole bone strength or intrinsic bone tissue quality. Initial OB-MK co-culture experiments showed a trend for an inhibitory or no effect of JAK2V617F MKs from female mice on OB differentiation. An osteogenesis gene expression array was used to test JAK2V617F MKs from female mice in comparison to control MKs, showing that the majority of the differentially expressed transcripts pointed to an OB inhibitory profile as well. However, a vast increase in the expression of the bone differentiation promoting factor, Bone Morphogenetic Protein Receptor type-1B could contribute to the bone gain observed in the JAK2V617F female mice, compared to their matching controls. Among other factors, lysyl oxidase (LOX) was found to be highly elevated in MKs from PMF patients and in mouse models of PMF. This enzyme has been studied both in context of bone formation and fibrosis. In Aim 3 of this dissertation, we also examined the innovative contention that MK LOX plays a significant role in controlling bone integrity under normal conditions, which if found to be the case, would motivate future studies on the role of MK LOX in shaping bone changes in PMF. Previous studies examined the role of LOX in bone formation. However, the role of MK LOX in MK and bone development had not been investigated. To this end, we generated transgenic mice that have LOX deleted in their MKs, by utilizing the Cre-lox system with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR/Cas9) technology. Deletion of LOX in MKs did not affect MK development, since MK number and ploidy did not change. However, MK LOX affected bone volume in a sex-dependent way. There was increased bone volume in male mice that have LOX specifically deleted in their MKs compared to control mice, while no difference was observed in the females compared to matching controls. The upregulation of Bone Morphogenetic Protein 2, Alkaline phosphatase and Fibronectin 1 (associated with osteogenesis) in the MKs of the male transgenic animals could account for the increased bone volume. The male transgenic mice had inferior apparent bone mechanical properties compared to their controls, which could be explained by the disrupted collagen profile that was observed in their bones. The increased expression of Matrix Metallopeptidase 8 (which is involved in collagen degradation) in these animals further supports these findings. These intriguing results will serve as basis for future mechanistic investigations. Together, this research dissertation provides important new knowledge regarding sex-dependent changes in bone volume and properties in PMF, enabled by JAK2V617F-induced reprograming of MKs towards expression of OB differentiation-promoting factors. As mentioned earlier, literature suggests that osteosclerosis is a serious complication of some forms of MPNs. Our new findings that JAK2V617F mutated male mice present with significant bone loss highlight a gap in human studies, since comparison according to patients’ sex was not reported in the existing literature. Further, we made the new discovery that LOX specifically expressed in MKs contributes to bone homeostasis in male mice. Both aims of study provide ground for future investigation of effects of sex hormone-related changes on bone in PMF.

Οι αλλαγές στην ανάπτυξη και την ομοιόσταση των οστών που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια των μυελοϋπερπλαστικών νεοπλασμάτων είναι πολύπλοκες και χρειάζεται περαιτέρω έρευνα για τη διαλεύκανση των υπεύθυνων μηχανισμών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασα στην πρωτοπαθή μυελοΐνωση, μια μορφή μυελοϋπερπλαστικού νεοπλασμάτος, που χαρακτηρίζεται από υπέρμετρο πολλαπλασιασμό μεγακαρυοκυττάρων και ίνωση του μυελού των οστών. Με βάση την υπάρχουσα βιβλιογραφία, η οστεοσκλήρυνση (ανώμαλη σκλήρυνση των οστών) αποτελεί σοβαρή επιπλοκή μερικών μορφών μυελοϋπερπλαστικών νεοπλασμάτων. Παρόλο που σχετίζεται με προοδευτική ανεπάρκεια του μυελού των οστών και έντονο πόνο στις αρθρώσεις και τα οστά, η εκδήλωση και αιτιολογία της παραμένουν ακόμα άγνωστες. Ο αυξημένος αριθμός των μεγακαρυοκυττάρων θα μπορούσε να εμπλέκεται στις οστικές αλλαγές, καθώς έχει δειχθεί ότι τα μεγακαρυοκύτταρα μπορούν και επηρεάζουν τη διαφοροποίηση οστικών κυττάρων.Αρκετές μελέτες δείχνουν πως υπάρχει αυξημένος όγκος οστών στην πρωτοπαθή μυελοΐνωση, χωρίς ωστόσο να γίνονται αναφορές και σύγκριση μεταξύ των δύο φύλων. Στους Σκοπούς 1 και 2 της παρούσας διατριβής, χρησιμοποιήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν την ανθρώπινη μετάλλαξη JAK2V617F υπό τον υποκινητή Vav. Με τη χρήση τους, διερευνήσαμε πώς αυτή η μετάλλαξη επηρεάζει την οστική πυκνότητα και δύναμη στα δύο φύλα (Σκοπός 1). Με ανάλυση της τομογραφίας με μικροϋπολογιστή (micro-CT) παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές και στα δύο φύλα, αλλά η επίδραση στο σπογγώδες οστό ήταν αντίθετη μεταξύ αρσενικών και θηλυκών, με αυξημένο όγκο στα θηλυκά και μειωμένο στα αρσενικά συγκριτικά με τις ομάδες ελέγχου. Τα αρσενικά διαγονιδιακά ποντίκια παρουσίασαν οστεοπόρωση στην περιοχή της διάφυσης, έχοντας μικρότερη ποσότητα μεταλλικών στοιχείων και ελαττωμένο πάχος φλοιώδους οστού συγκρινόμενα με την ομάδα ελέγχου. Επίσης, είχαν τάση για μικρότερες ροπές ενέργειας, που είναι ένας από τους βασικούς δείκτες αντοχής των οστών. Για αυτό προχωρήσαμε σε μηχανικό έλεγχο (mechanical testing ή αλλιώς three point bending) και διαπιστώσαμε ότι οι μηχανικές ιδιότητες των οστών τους είναι παρόμοιες ή ελαφρώς κατώτερες από την ομάδα ελέγχου. Με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα αξιολογήσαμε τα οστά σε επίπεδο ιστού προκειμένου να εξετάσουμε τυχόν διαφορές στη διαδικασία ανοργανοποίησης. Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι οι ιστοί από τα αρσενικά ποντίκια JAK2V617F περιέχουν περισσότερο οστεοειδές, το οποίο είναι το μη μεταλλοποιημένο οργανικό τμήμα της μήτρας των οστών που σχηματίζεται πριν από την ωρίμανση του οστικού ιστού, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ποντίκια ελέγχου. Αυτό έδειξε ότι η φυσιολογική διαδικασία ανοργανοποίησης παρεμποδίζεται στα αρσενικά ποντίκια JAK2V617F.Το επόμενο βήμα (Σκοπός 2 της διατριβής) ήταν να διερευνηθεί πώς τα μεγακαρυοκύτταρα που προέρχονται από αρσενικά ποντίκια JAK2V617F επηρεάζουν τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών που είναι υπεύθυνοι για τη διαδικασία ανοργανοποίησης. Έτσι προχωρήσαμε σε συγκαλλιέργειες μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων του μυελού των οστών με μεγακαρυοκύτταρα, χρησιμοποιώντας κύτταρα από αρσενικά ποντίκια και συνθήκες καλλιέργειας που προάγουν τη διαφοροποίηση προς οστεοβλάστες (για αυτό αναφέρεται επίσης ως συγκαλλιέργεια οστεοβλαστών-μεγακαρυοκυττάρων). Η παρουσία των JAK2V617F μεγακαρυοκυττάρων και/ή του υπερκειμένου τους, μείωσε σημαντικά τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών.Αναζητώντας πιθανά μόρια που ευθύνονται για την επίδραση των μεγακαρυοκυττάρων JAK2V617F στην οστεογένεση, χρησιμοποιήσαμε μια συστοιχία που εξετάζει mRNA σχετιζόμενα με οστεογένεση. Υπήρχε αυξημένη έκφραση των γονιδίων Noggin, Chordin, Alpha-2-HS-glycoprotein, Collagen type IV alpha 1 and Collagen type XIV alpha 1 (γνωστά για τις ανασταλτικές τους ιδιότητες ως προς τη διαφοροποίηση των οστών) και μειωμένη έκφραση των γονιδίων Alkaline phosphatase, Vascular cell adhesion molecule 1, Sclerostin, Distal-less homeobox 5 and Collagen type III alpha 1 (που σχετίζονται με οστεογένεση) στα μεγακαρυοκύτταρα των αρσενικών ποντικιών JAK2V617F συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Για τα γονίδια με μεγάλες αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης, προσπαθήσαμε να πραγματοποιήσουμε πειράματα για να εξετάσουμε τη συμβολή τους στην ανασταλτική επίδραση που παρατηρήσαμε στις συγκαλλιέργειες. Παρόλα αυτά, έγινε εμφανές ότι τα μεγακαρυοκύτταρα με τη μετάλλαξη JAK2V617F υφίστανται μία ολική αλλαγή στον προγραμματισμό των γονιδίων, περιλαμβάνοντας διάφορα μονοπάτια που συνδέονται με την αναστολή της οστεογένεσης. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι ένας συνδυασμός αλλαγών, και όχι μόνο μία αλλαγή, είναι υπεύθυνος για την ανασταλτική επίδραση των μεταλλαγμένων μεγακαρυοκυττάρων στη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Σε αντίθεση με τα αρσενικά ποντίκια JAK2V617F, η ανάλυση micro-CT σε θηλυκά ποντίκια με αυτή τη μετάλλαξη έδειξε ότι έχουν αυξημένο όγκο οστών συγκρινόμενα με την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, έπειτα από διενέργεια μηχανικού ελέγχου διαπιστώθηκε ότι οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στα θηλυκά ποντίκια, οφείλονταν πιθανότατα σε διαφορές στη γεωμετρία των οστών και όχι σε διαφορές στις εγγενείς ιδιότητες υλικού του οστού. Αυτό υποδηλώνει πως η δύναμη του οστού και η ποιότητά του στα θηλυκά δεν επηρεάζονται σημαντικά από τη μετάλλαξη JAK2V617F. Προκαταρκτικά πειράματα με συγκαλλιέργειες οστεοβλαστών-μεγακαρυοκυττάρων, χρησιμοποιώντας κύτταρα από θηλυκά ποντίκια, έδειξαν ότι τα μεγακαρυοκύτταρα από θηλυκά διαγονιδιακά ποντίκια τείνουν να αναστέλλουν ή δεν επηρεάζουν τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Η ίδια συστοιχία που χρησιμοποιήθηκε για τα αρσενικά ποντίκια χρησιμοποιήθηκε και για τα θηλυκά για να ανιχνευθούν τυχόν διαφορές στην έκφραση γονιδίων. Η πλειοψηφία των διαφορετικά εκφραζόμενων μεταγράφων φαίνεται και πάλι να έχει ανασταλτική επίδραση στους οστεοβλάστες. Ωστόσο, η αυξημένη έκφραση του Bmpr1b θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στο μεγαλύτερο όγκο οστών που παρατηρείται στα θηλυκά ποντίκια JAK2V617F. Μεταξύ άλλων παραγόντων, το ένζυμο της οξειδάσης της λυσίνης (LOX) έχει βρεθεί να εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στα μεγακαρυοκύτταρα ασθενών αλλά και ζωικών μοντέλων με πρωτοπαθή μυελοΐνωση. Αυτό το ένζυμο έχει μελετηθεί στα πλαίσια του σχηματισμού των οστών και της ίνωσης του μυελού των οστών. Στον Σκοπό 3 της παρούσας διατριβής εξετάσαμε επίσης την καινοτόμο ιδέα ότι η οξειδάση της λυσίνης που προέρχεται από τα μεγακαρυοκύτταρα παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της οστικής ακεραιότητας υπό φυσιολογικές συνθήκες, κάτι που αν όντως ισχύει θα δώσει το έδαφος σε μελλοντικές μελέτες σχετικά με τις οστικές αλλαγές που παρατηρούνται στην πρωτοπαθή μυελοΐνωση. Προηγούμενες μελέτες εξέτασαν το ρόλο της οξειδάσης της λυσίνης στο σχηματισμό των οστών. Ωστόσο, ο ρόλος αυτού του ενζύμου όταν προέρχεται συγκεκριμένα από τα μεγακαρυοκύτταρα, στη φυσιολογική ανάπτυξη των μεγακαρυοκυττάρων και των οστών δεν έχει διερευνηθεί. Για αυτό το σκοπό, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια με απενεργοποιημένο το γονίδιο της οξειδάσης της λυσίνης στα μεγακαρυοκύτταρα, αξιοποιώντας τη μέθοδο Cre-lox με την τεχνολογία CRISPR-Cas9. Η απενεργοποίηση του γονιδίου δεν επηρέασε τη φυσιολογική ανάπτυξη των μεγακαρυοκυττάρων, αφού ο αριθμός τους και ο αριθμός πολυπλοειδίας τους παρέμειναν αμετάβλητοι. Παρ’όλα αυτά, επηρέασε το σχηματισμό των οστών μόνο στο αρσενικό γένος. Υπήρχε αυξημένος οστικός σχηματισμός στα ποντίκια αρσενικού γένους που είχαν απενεργοποιημένο το γονίδιο της οξειδάσης της λυσίνης στα μεγακαρυοκύτταρά τους, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά στα αντίστοιχα ποντίκια θηλυκού γένους συγκριτικά με τις ομάδες ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα θα χρησιμεύσουν ως βάση για μελλοντικές μηχανιστικές έρευνες. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη παρέχει σημαντική και καινούργια γνώση σχετικά με τις διαφορές που παρατηρούνται στον όγκο και στις ιδιότητες των οστών στα δύο γένη στην πρωτοπαθή μυελοϊνωση από τον επαναπρογραμματισμό των μεγακαρυοκυττάρων. Όπως προαναφέρθηκε, η βιβλιογραφία προτείνει ότι η οστεοσκλήρυνση αποτελεί σοβαρή επιπλοκή κάποιων μορφών μυελοϋπερπλαστικών νεοπλασμάτων. Τα καινούργια ευρήματά μας σχετικά με τη μείωση του οστικού όγκου στα αρσενικά ποντίκια JAK2V617F τονίζουν το κενό που υπάρχει στην υπάρχουσα βιβλιογραφία, καθώς δεν έχει γίνει σύγκριση ανάμεσα στα δύο γένη. Επίσης, ανακαλύψαμε ότι η οξειδάση της λυσίνης που προέρχεται από τα μεγακαρυοκύτταρα συμβάλλει στην ομοιόσταση των οστών στα αρσενικά ποντίκια. Και οι δύο κύριοι στόχοι της μελέτης δίνουν έδαφος για μελλοντική διερεύνηση των επιπτώσεων των αλλαγών που σχετίζονται με τις ορμόνες του φύλου στα οστά στο πλαίσιο της πρωτοπαθούς μυελοΐνωσης.