Effect of wetting phenomena on biofilm formation and removal

Abstract

This Ph.D. work is devoted to examining the effect of wetting phenomena on biofilm formation and removal. Biofilm can be defined as a layer of microorganisms stuck to each other and to a solidsurface. The importance of biofilms is enormous in different industrial applications and human everyday life. The effects of biofilms could be either positive or negative. Positive effects are found in industrial processes, bioremediation, and wastewater treatments. Negative effects are more common with the marine industry being one of the sectors, which challenges severe corrosion problems caused by biofouling, and industrial settings, where biofilms are responsible of contaminations, causing severe clogging of hydraulic systems with consequent energy loss and possible shutdowns or in the reduction of conductive heat transfer across surfaces. On the other hand, biofilms can contaminate biomedical devices and cause human infections and diseases.Typically, biofilms are recognized as morphologically complex and porous structures. One of the most important surface property of biofilms is wettability, which dictates how a liquid spreads over the surface of biofilms but also how it penetrates within the porous/textured structure. In this regard, wettability can be seen as an important tool to understand biofilm morphology and surface properties at different growth conditions. Wetting of biofilms by external liquids is also fundamental to investigate how to prevent biofilm formation on solid surfaces or how to remove them from already-contaminated surfaces.Wetting of biofilms grown on solid substrates represents an interesting but not well-studied topic. Recent literature has only focused on wettability of biofilm-colonies grown on Agar (at air-solid interfaces), showing different wetting behaviours i.e., from hydrophilic to superhydrophobic, according to selected nutrient conditions. On the other hand, contact angle measurements of sessile droplets on hydrophilic bacterial lawns, after dehydration, are frequently used in physicochemical models as a measure of microbial cell surface structure. However, wetting behaviour of biofilms grown on real solid substrates i.e., where industrial biofilms are formed at the internal surface of pipes, tanks, valves, etc (at the liquid-solid interface, also known as submerged biofilms), has not been explored yet in the literature.In addition to the above, it is also not well-investigated in literature how the interaction between bacteria-laden droplets with solid substrates affects microbial spreading and surface contamination, representing the precursor steps of biofilm formation.In this doctoral thesis, wetting/dewetting properties of dehydrated submerged biofilms are investigated. A single bacterial strain-Pseudomonas fluorescens is chosen as model microorganism. It is a Gram negative, rod-shaped and aerobic bacteria, known to form biofilms in food industry, causing enormous problems such as clogging of industrial facilities and cross contamination of food products. This thesis can be divided in the following sections.The first section is devoted to establishing valid methodologies to characterise biofilms under different growth conditions. Preliminary results of static contact angles of polar and non-polar liquids on biofilm-covered surfaces after dehydration are presented. The role of different growth conditions i.e., type of nutrient medium, nutrient concentration and shear flow conditions on biofilm morphology and wetting properties has been examined, since, for porous/micropatterned surfaces like biofilms, it is well known that wettability is strongly affected by surface properties such as morphology, which, is driven by the different biofilm growth conditions i.e., nutrient composition, shear flow or incubation time. Moreover, wetting by external water on porous systems is actually a spontaneous phenomenon. Biofilm dehydration leaves behind a solid matrix of complex morphology. Interestingly, such matrix induces peculiar water droplet spreading and imbibition within the pores. Static contact angle measurements also reveals that, biofilms of higher growth times exhibit higher porosity and bigger hydrophilicity. In the second section, wetting results are extended to the application of external body forces on sessile droplets (forced wetting) lying on dehydrated biofilms, which can drive the system beyond thermodynamic equilibrium. A recent-built device named Kerberos, has been employed to perform forced wetting experiments. Kerberos is capable of subjecting sessile droplets at different tilting angles to varying centrifugal forces in order to explore the shape evolution and the spreading/sliding behaviour of droplets on biofilm-covered surfaces. Kerberos also provides independent control of the normal and tangential forces applied to the droplet as it allows simultaneous rotation and tilting of the droplet supporting plate. Kerberos is also supported by a software tool developed for the analysis of droplet images acquired by three Wi-Fi video cameras viewing the droplet simultaneously from the top, side and back, extracting information from images. Basic 2D features of the forced wetting phenomena of dehydrated porous biofilms (such as front and rear contact angles, droplet length and height, contact point coordinates, contour profiles, contour perimeter and Cox circularity) up to the onset of droplet sliding are provided as a tool to examine biofilm morphology using an appropriate image analysis scheme for data extraction and evaluation. In this regard, experiments are conducted by applying centrifugal forces at defined increasing speed rate. The effect of growth conditions i.e., nutrient concentration, shear flow and growth time, on forced wetting properties of biofilms by external liquids is investigated. Poorly-coated biofilms, obtained under lower nutrient/shear flow conditions or incubation times, show similar forced wetting characteristics of those of uncoated substrates. Higher incubation times, shear flow as well as nutrient concentration induce rougher and denser biofilm structures, corresponding to intriguing droplet spreading during the rotation tests. Specifically, as rotation speed increases, a long liquid tail forms progressively at the rear part of the droplet, which stays pinned, while only the front part of the droplet depins and spreads. The third section is dedicated to the analysis of spreading/sliding behaviour of bacteria-laden droplets on clean solid surfaces, to understand bacterial adhesion and spreading, which represent early stages of biofilm formation. Forced wetting experiments are carried out right after partial droplet evaporation to encourage bacterial settling on surfaces, imposing controlled centrifugal forces in similar way to the case of water onto biofilm systems. The experimentally-derived retention force needed for the onset of droplet sliding, which is an indirect measure of bacteria adhesion force, is effectively affected by the evaporation time. At shortevaporation times, spreading/sliding phenomena of bacterial droplets are attained similarly to the case of those of water on pure glass. Higher evaporation times promotes a greater liquid loss leading to bigger bacterial deposition onto surfaces, corresponding to droplet depinning during the rotation test.Overall, this Ph.D. work refers to the study of static and forced wetting of dehydrated porous/complex surfaces by external liquids, which were not investigated before in literature, although there is a vast literature concerning pinning/depinning behaviour of sessile droplets on (non-biological) heterogenous/complex patterned substrates. In addition, interesting information regarding spreading and adhesion of microbes-laden droplets onto pure surfaces is reported resembling actual industrial conditions of droplet evaporation after spill over or splashing. This is also new in literature. The findings of this thesis have been reported in four publications in international peer reviewed science journals and have been presented in seven national and international conferences.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της επίδρασης των φαινομένων διαβροχής κατά τον σχηματισμό, την ανάπτυξη και την αποκόλληση βιοϋμενίων. Τα βιοϋμένια ορίζονται ως ένα στρώμα (υμένιο) μικροοργανισμών ενωμένων μεταξύ τους σε οργανωμένες δομές και προσκολλημένων συνήθως σε μια στερεή επιφάνεια. Η σημασία των βιοϋμενίων είναι μεγάλη σε διάφορες βιομηχανικές εφαρμογές και στην καθημερινή ζωή του ανθρώπου. Σε ορισμένες βιομηχανικές διεργασίες, καθώς επίσης και κατά τη βιο-εξυγίανση ή την επεξεργασία λυμάτων, η ανάπτυξη βιοϋμενίων είναι επιθυμητή και συχνά καθοριστική για την αποτελεσματικότητά τους. Ωστόσο, η ανάπτυξη βιοϋμενίων συνηθέστερα σχετίζεται με σημαντικές αρνητικές επιπτώσεις, κυρίως λόγω της παρατηρούμενης βιοδιάβρωσης, π.χ. στη ναυτιλιακή βιομηχανία ή της μόλυνσης των τελικών προϊόντων, π.χ. στη βιομηχανία τροφίμων. Η ανάπτυξη βιοϋμενίων στον ιατρικό εξοπλισμό μπορεί να προκαλέσει ανθρώπινες λοιμώξεις και ασθένειες, καθώς επίσης η ανάπτυξή τους σε συστήματα νερού μπορεί να προκαλέσει δυσλειτουργίες σε αυτά, όπως μείωση της μεταφοράς θερμότητας, απώλεια ενέργειας, ακόμη και πλήρη αστοχία τους. Τυπικά, τα βιοϋμένια αναγνωρίζονται ως μορφολογικά πολύπλοκες και πορώδεις δομές. Μια από τις πιο σημαντικές επιφανειακές ιδιότητες των βιοϋμενίων είναι η ικανότητα διαβροχής, η οποία υπαγορεύει τον τρόπο με τον οποίο ένα υγρό απλώνεται στην επιφάνεια των βιοϋμενίων αλλά και πώς διεισδύει μέσα στην πορώδη/ διαμορφωμένη δομή. Υπό αυτή την έννοια, η ικανότητα διαβροχής μπορεί να θεωρηθεί ως ένα σημαντικό εργαλείο για την κατανόηση της μορφολογίας των βιοϋμενίων και των ιδιοτήτων της επιφάνειάς τους σε διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης. Επιπλέον, η διαβροχή των βιοϋμενίων από υγρά είναι θεμελιώδης για τη διερεύνηση του τρόπου πρόληψης του σχηματισμού τους σε στερεές επιφάνειες ή του τρόπου αφαίρεσής τους από ήδη μολυσμένες επιφάνειες. Η διαβροχή των βιοϋμενίων που αναπτύσσονται σε στερεά υποστρώματα αποτελεί ένα ενδιαφέρον αλλά όχι διεξοδικά μελετημένο θέμα. Η πρόσφατη βιβλιογραφία έχει επικεντρωθεί στη μελέτη της ικανότητας διαβροχής των αποικιών ορισμένων μικροοργανισμών, που αναπτύσσονται σε άγαρ (σε διεπιφάνεια στερεού – αέρα). Οι σχηματιζόμενες αποικίες παρουσιάζουν συμπεριφορές διαβροχής από υδρόφιλες έως υπέρ-υδρόφοβες, ανάλογα με το είδος του οργανισμού και τις επιλεγμένες συνθήκες ανάπτυξής τους. Από την άλλη πλευρά, οι μετρήσεις της γωνίας επαφής σταγονιδίων νερού σε επιφάνειες καλυμμένες με βακτήρια που παρουσιάζουν υδρόφιλα χαρακτηριστικά, οι οποίες έχουν υποστεί αφυδάτωση, χρησιμοποιούνται συχνά σε φυσικοχημικά μοντέλα, ως μέτρο της δομής της μικροβιακής κυτταρικής επιφάνειας. Ωστόσο, δεν έχουν μελετηθεί τα χαρακτηριστικά διαβροχής των βιοϋμενίων που αναπτύσσονται σε πραγματικά στερεά υποστρώματα, και που συναντώνται συχνά σε βιομηχανικά συστήματα, όπως π.χ. στο εσωτερικό σωληνώσεων (δηλαδή βιοϋμένια που έχουν σχηματιστεί σε διεπιφάνεια στερεού – υγρού, επίσης γνωστά ως βυθισμένα βιοϋμένια). Επιπρόσθετα, δεν έχει επίσης διερευνηθεί διεξοδικά στη βιβλιογραφία πώς η αλληλεπίδραση μεταξύ σταγονιδίων που περιέχουν βακτήρια με στερεά υποστρώματα επηρεάζει τη μικροβιακή εξάπλωση και τη μόλυνση μιας επιφάνειας, η οποία αντιπροσωπεύει ουσιαστικά τα πρόδρομα στάδια του σχηματισμού βιοϋμενίων. Σε αυτήν τη διδακτορική διατριβή, διερευνώνται οι ιδιότητες διαβροχής αφυδατωμένων βιοϋμενίων που έχουν αναπτυχθεί σε διεπιφάνεια στερεού – υγρού. Η παρούσα διδακτορική διατριβή απαρτίζεται από τις ακόλουθες ενότητες.Στην πρώτη ενότητα μελετώνται και παρουσιάζονται οι μεθοδολογίες για τον χαρακτηρισμό των βιοϋμενίων που έχουν αναπτυχθεί κάτω από διαφορετικές συνθήκες. Παρουσιάζονται προκαταρκτικά αποτελέσματα σχετικά με τις γωνίες επαφής που σχηματίζουν σταγόνες πολικών και μη πολικών υγρών σε επιφάνειες καλυμμένες με βιοϋμένια μετά την αφυδάτωσή τους. Επίσης, εξετάζεται ο ρόλος των διαφορετικών συνθηκών ανάπτυξης, π.χ. του τύπου του θρεπτικού μέσου, της συγκέντρωσης θρεπτικών συστατικών και των συνθηκών ροής στη μορφολογία των βιοϋμενίων και στα χαρακτηριστικά διαβροχής τους, καθώς, για πορώδεις/ μικροδιαμορφωμένες επιφάνειες όπως τα βιοϋμένια, η ικανότητα διαβροχής επηρεάζεται έντονα από τη μορφολογία, η οποία καθορίζεται από τις διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης των βιοϋμενίων, π.χ. τη σύνθεση θρεπτικών συστατικών, τα χαρακτηριστικά της ροής ή τον χρόνο επώασης. Στη δεύτερη ενότητα, παρουσιάζεται η επίδραση εξωτερικών δυνάμεων σε σταγόνες νερού (εξαναγκασμένη διαβροχή), οι οποίες εναποτίθενται σε αφυδατωμένα βιοϋμένια, με σκοπό το σύστημα να μελετηθεί σε συνθήκες πέρα από τη θερμοδυναμική ισορροπία. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε μια καινοτόμος συσκευή, που ονομάζεται Kerberos, η οποία κατασκευάστηκε πρόσφατα στο εργαστήριο και χρησιμοποιείται ειδικά για τη μελέτη της εξαναγκασμένης διαβροχής. Σταγόνα υγρού συγκεκριμένου όγκου τοποθετείται σε επιφάνεια στερεού (ή βιοϋμενίου) σε διαφορετικές γωνίες κλίσης και εφαρμόζονται φυγόκεντρες δυνάμεις προκειμένου να διερευνηθεί η εξέλιξη του σχήματος της σταγόνας και η συμπεριφορά εξάπλωσης/ολίσθησής της. Η συσκευή Kerberos παρέχει τη δυνατότητα ελέγχου των δυνάμεων που εφαρμόζονται στη σταγόνα, καθώς επιτρέπει την ταυτόχρονη περιστροφή και κλίση της επιφάνειας στην οποία τοποθετείται η σταγόνα. Η συσκευή Kerberos διαθέτει κατάλληλο λογισμικό, το οποίο αναπτύχθηκε για την ανάλυση των εικόνων των σταγονιδίων που λαμβάνονται από τις τρεις συνδεδεμένες (με Wi-Fi) βιντεοκάμερες, οι οποίες καταγράφουν τη σταγόνα ταυτόχρονα από την κορυφή, το πλάι και το πίσω μέρος. Στο πλαίσιο της διατριβής, μελετήθηκαν τα φαινόμενα της εξαναγκασμένης διαβροχής αφυδατωμένων βιοϋμενίων, από την τοποθέτηση της σταγόνας μέχρι την έναρξη της ολίσθησής της, με στόχο την εξέταση της μορφολογίας τους. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση των συνθηκών ανάπτυξης, δηλαδή της συγκέντρωσης θρεπτικών ουσιών και της ταχύτητας του νερού πάνω από την επιφάνεια ανάπτυξης του βιοϋμενίου, στα χαρακτηριστικά της εξαναγκασμένης διαβροχής. Στην τρίτη ενότητα αναλύεται η συμπεριφορά εξάπλωσης/ολίσθησης σταγονιδίων που περιέχουν βακτήρια σε καθαρές επιφάνειες με σκοπό την κατανόηση της βακτηριακής πρόσφυσης και εξάπλωσης, τα οποία αντιπροσωπεύουν πρώιμα στάδια σχηματισμού των βιοϋμενίων. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν αμέσως μετά τη μερική εξάτμιση των σταγονιδίων, ώστε να ενισχυθεί η ικανότητα καθίζησης των βακτηρίων στις επιφάνειες. Προέκυψε ότι ο χρόνος εξάτμισης επηρεάζει τη δύναμη που πρέπει να ασκηθεί για την έναρξη της ολίσθησης των σταγονιδίων. Η δύναμη αυτή αποτελεί ένα έμμεσο μέτρο της δύναμης πρόσφυσης των βακτηρίων στην επιφάνεια.Η παρούσα διδακτορική διατριβή αναφέρεται στη μελέτη της διαβροχής αφυδατωμένων επιφανειών βιοϋμενίων από υγρά,. Επιπλέον, παρουσιάζονται ενδιαφέροντα ευρήματα σχετικά με την εξάπλωση και την προσκόλληση σταγονιδίων μικροοργανισμών σε καθαρές επιφάνειες. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έχουν ανακοινωθεί σε τέσσερις δημοσιεύσεις σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά με κριτές και έχουν παρουσιαστεί σε επτά εθνικά και διεθνή συνέδρια.