Σύνθεση αμφίφιλων πολυπεπτιδικών πολυμερών βασισμένα στην πολυ(ιστιδίνη), για τη μελέτη εγκλωβισμού και αποδέσμευσης αντικαρκινικών φαρμάκων

Abstract

In the present research project, the synthesis of a series of hybrid polypeptide copolymers based on poly(histidine) is presented. The synthesis of polymers was achieved through ring-opening polymerization (ROP) process of the corresponding protected N-carboxy anhydrides (monomers), using an amine end-functionalized poly(ethylene oxide) (mPEO-NH2) macroinitiator. High-vacuum techniques were used for the synthesis of N-carboxy anhydrides of α-amino acids, for the purification of solvents and for the isolation of well-defined polymers as well, ensuring the high purity of the system. The successful synthesis of the polymers was confirmed by Size Exclusion Chromatography (SEC), proton Nuclear Magnetic Resonance (1H- NMR) and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). In addition, the relation between the secondary structure of the polypeptides, and the pH and the temperature were studied, using the technique of circular dichroism (CD). Dynamic Light Scattering (DLS) was employed, in order to investigate the ability of the polypeptides to self-assemble into micelles, as well as their size. Z-potential measurements revealed the surface charge of the synthesized nanoparticles. These amphiphilic copolymers of the PEO-b-PHis type possess the ability to self- assemble in aqueous media and form micelle-like nanostructures, comprised of an outer hydrophilic corona of poly(ethylene oxide) chains, and a pH- responsive hydrophobic core based on poly(histidine). These nanoparticles have the ability to encapsulate and release the anticancer drug of cis-platin in a controlled manner at cancer tissue conditions, as well as doxorubicin, as in vitro trials in breast cancer cell lines revealed.Finally, a new facile strategy for the synthesis of hybrid nanoparticles containing gold nanoshells (AuNSs) that absorb at near-infrared is presented. Poly(ethylene oxide)-b-poly(L-histidine), poly(ethylene oxide)-b-poly(L-histidine)-b-poly(L- phenylalanine) and poly(ethylene oxide)-b-poly(L-histidine)-b-poly(γ-benzyl-L- glutamate) hybrid copolypeptides were used for the development of AuNSs. Spherical nanoparticles (NPs) were initially formed by the self-assembly of the amphiphilic hybrid polypeptides in water. The addition of HAuCl4 followed by heating, resulted on the reduction of the Au(III) by PHis leading to the formation of gold nanoparticles only at the layer of PHis, thus forming a nanoshell within the preformed NPs. The NPs formed are composed of a PEO shell, a PHis layer containing the nanoshell and a PPhe or PBLG core. By controlling the AuNS thickness and the core diameter by the molecular characteristics of the polymeric precursors as well as the PHis/Au(III) ratio, the optical properties of the AuNSs can be fine-tuned to absorb at a specific wavelength. Thus, we achieved a shift of the absorption peak corresponding to longitudinal surface plasmon resonance to NIR wavelengths. The size and the morphology of AuNPs were examined by TEM and Dynamic Light Scattering. Studies on the temperature increase of NP solutions irradiated by a low radiation laser at 808 nm showed the ability of the NPs to induce thermal ablation to cells. We present a novel approach for the design and facile synthesis of biocompatible polymeric nanoparticles featuring AuNSs with a peak optical absorption in the NIR, rendering them useful biomaterials not only for molecular imaging but also for photothermal therapy.

Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή παρουσιάζεται η σύνθεση μίας σειράς πολυπεπτιδικών συμπολυμερών βασισμένα στην πολυ(ιστιδίνη). Η σύνθεσή τους πραγματοποιήθηκε μέσω πολυμερισμού διάνοιξης δακτυλίου των προστατευμένων Ν-καρβοξυ ανυδριτών (μονομερή), με χρήση αμινο-τελικού πολυ(αιθυλενοξειδίου) (mPEO-NH2) ως μακροαπαρχητή. Για τη σύνθεση των Ν- καρβόξυ ανυδριτών των α-αμινοξέων, τον καθαρισμό των διαλυτών, αλλά και για τη λήψη καλά καθορισμένων πολυμερών, χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές υψηλού κενού, εξασφαλίζοντας υψηλή καθαρότητα στο σύστημα. Η επιτυχής σύνθεση όλων των πολυμερών επιβεβαιώθηκε με τις τεχνικές της χρωματογραφίας αποκλεισμού μεγεθών (SEC), του πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου (1Η-NMR) και της φασματοσκοπίας υπερύθρου (FT-IR). Επιπλέον, μελετήθηκε η εξάρτηση της δευτεροταγούς δομής των πολυπεπτιδίων από το pH και τη θερμοκρασία με την τεχνική του κυκλικού διχρωϊσμού (CD). Η τεχνική της Δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) χρησιμοποιήθηκε, προκειμένου να μελετηθεί η ικανότητα αυτοοργάνωσης και το μέγεθος των συντιθέμενων νανοσωματιδίων, ενώ το επιφανειακό τους φορτίο προσδιορίστηκε με την τεχνική του ζ-δυναμικού. Επιπροσθέτως, αποδείχθηκε ότι τα πολυπεπτιδικά πολυμερή του τύπου PEO-b- PHis έχουν την ικανότητα να αυτοοργανώνονται σε υδατικά διαλύματα και να σχηματίζουν μικυλλιακές δομές, από υδρόφιλο κέλυφος πολυ(αιθυλενοξειδίου) και υδρόφοβο pH-αποκρινόμενο πυρήνα πολυ(ιστιδίνης). Το πολυπεπτιδικό συμπολυμερές PEO-b-PHis έχει την ικανότητα να εγκλωβίζει και να αποδεσμεύει το αντικαρκινικό φάρμακο της σισπλατίνης, με ένα στοχευμένο και ελεγχόμενο τρόπο, σε συνθήκες καρκινικού ιστού, αλλά και της δοξορουβικίνης, όπως αποκάλυψαν in vitro μελέτες αποδέσμευσης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού.Τέλος, παρουσιάζεται μια καινούρια, απλή και έξυπνη στρατηγική για τη σύνθεση υβριδικών νανοσωματίδιων που περιέχουν νανοκελύφη χρυσού (AuNSs) και έχουν την ικανότητα να απορροφούν στην εγγύς υπέρυθρη ακτινοβολία (near- infrared). Υβριδικά πολυπεπτίδια του τύπου poly(ethylene oxide)-b-poly(L- histidine), poly(ethylene oxide)-b-poly(L-histidine)-b-poly(L-phenylalanine) και poly(ethylene oxide)-b-poly(L-histidine)-b-poly(γ-benzyl-L-glutamate) συντέθηκαν για την ανάπτυξη των AuNSs. Αρχικά σχηματίστηκαν σφαιρικά νανοσωματίδια (NPs) από την αυτό-οργάνωση των αμφίφιλων συμπολυπετιδίων στο νερό. Η προσθήκη του HAuCl4 και η θέρμανση που ακολούθησαν, είχαν ως αποτέλεσμα στην αναγωγή του Au(III) από την PHis οδηγώντας στον σχηματισμό νανοσωματιδίων χρυσού μόνο στο στρώμα της PHis με αποτέλεσμα το σχηματισμό νανοκελύφους χρυσού. Τα συντιθέμενα νανοσωματίδια αποτελούνται από μια εξωτερική στιβάδα PEO, από μια στιβάδα PHis, η οποία περιέχει τη νανοστιβάδα χρυσού και έναν πυρήνα PPhe ή PBLG αντίστοιχα. Ελέγχοντας το πάχος του AuNS και τη διάμετρο του πυρήνα από τα μοριακά χαρακτηριστικά των προδρόμων πολυμερών, καθώς και την αναλογία PHis/Au(III), οι οπτικές ιδιότητες των AuNSs μπορούν να ρυθμιστούν για να απορροφούν σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος. Έτσι, επιτύχαμε μια μετατόπιση του μεγίστου της απορρόφησης που αντιστοιχεί στον διαμήκη επιφανειακό συντονισμό πλασμονίου σε μήκη κύματος στο NIR. Το μέγεθος και η μορφολογία των AuNPs εξετάστηκαν με TEM και DLS. Μελέτες σχετικά με την αύξηση της θερμοκρασίας των διαλυμάτων NPs που ακτινοβολούνται με laser χαμηλής ακτινοβολίας στα 808 nm έδειξαν την ικανότητα των νανοσωματιδίων (NPs) να προκαλούν θερμική κατάλυση στα κύτταρα. Παρουσιάζουμε μια νέα προσέγγιση για το σχεδιασμό και την εύκολη σύνθεση βιοσυμβατών πολυμερικών νανοσωματιδίων με AuNSs με μέγιστη οπτική απορρόφηση στο NIR, καθιστώντας τα χρήσιμα βιοϋλικά όχι μόνο για μοριακή απεικόνιση αλλά και για φωτοθερμική θεραπεία.