Τοξικολογικοί δείκτες μικροβιακής παραγωγής αιθανόλης: μελέτη και πολυπαραμετρική ανάλυση σε μικροβιακές καλλιέργειες και νεκροτομικό υλικό

Abstract

Ethanol is the most widely and legally used toxic substance, characterized by addictive effects. The determination of postmortem blood ethanol concentration is part of the death investigation process, since ethanol might be a causal or contributory factor to the manner of death. The accurate scientific interpretation of the results of the ethanol analysis is of vital importance in forensic toxicology in cases where microbial ethanol production is suspected, or the origin of postmortem ethanol (ante-mortem ingestion or microbial production) is questioned. Ethanol can be formed postmortem by many microorganisms from all available substrates. Among others, other volatile compounds, the so-called higher alcohols (1-propanol, 1-butanol, isobutanol, 2-methyl-1-butanol (d-amyl alcohol) and 3-methyl-1-butanol (isoamyl alcohol)) might be co-detected. In previous studies from our research team, mathematical models were proposed to calculate microbially produced ethanol in cultures of the bacterial strains Escherichia coli, Clostridium perfringens, and Clostridium sporogenes at 25°C as a function of the concentrations of the higher alcohols 1-propanol, 1-butanol, isobutanol, and methyl-butanol (sum of d-amyl and isoamyl alcohol). In this contribution, liquid aerobic/anaerobic and strictly anaerobic cultures of selected microbial strains (the bacteria Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and the fungus Candida albicans) were prepared separately at different temperatures (37°C, 25°C and 4°C), in different culture media (Brain Heart Infusion, BHI (with or without additional glucose) and Sabouraud Dextrose Broth, SDB), as well as aerobic/anaerobic and strictly anaerobic microbial cultures in denatured human blood, acidic or neutral, at 25°C, with or without additional glucose. The concentrations of ethanol, higher alcohols, and other volatile compounds, naturally present in human blood or microbially produced, were determined by head space-gas chromatography-flame ionization detector (HS-GC-FID). The results were analyzed by multiple linear regression analysis and simple mathematical models were developed describing the correlation between ethanol concentration and the higher alcohols’ concentrations. The applicability of the models was tested in microbial cultures at 37°C, in microbial cultures of denatured human blood and in postmortem samples from autopsy cases. The higher ethanol concentrations, at 25°C and 37°C, were produced by C. albicans, followed by K. pneumoniae, S. aureus and E. faecalis. The patterns and concentrations of the higher alcohols and the other volatile compounds varied among the different microbial cultures, temperature and composition of the culture media. The higher ethanol concentrations in bacterial cultures of human denatured blood were produced by K. pneumoniae along with S. aureus, followed by E. faecalis. The ethanol concentrations produced by C. albicans were proportional to the additional glucose concentrations. Higher alcohols were not produced by all microbial denatured blood cultures. 1-Propanol, 1-butanol, isobutanol and methyl-butanol are indicators of microbial ethanol production, in qualitative and quantitative terms. 1-Propanol was the most significant alcohol in modeling bacterial ethanol production, while methyl-butanol was the most significant alcohol in modeling fungal ethanol production. The bacterial models applied better in samples from bacterial cultures than from fungal cultures at 37°C, while the fungal models applied to fungal samples and failed to apply to the samples from bacterial cultures. The bacterial models applied more successfully to microbial samples from denatured normal blood than the fungal models. On the contrary, the C. albicans models were applied better in samples from fungal denatured blood cultures. In general, the K. pneumoniae models showed the best applicability of all microbial models in postmortem samples from autopsy cases, followed by the E. faecalis model and the S. aureus models. The C. albicans models were the least successful. The best applicability of the bacterial models was observed in autopsy cases with blood ethanol concentration greater than 0.50 g/L, in cases of undetermined cause of death and in cases with putrefaction. Overall, the bacterial models could apply in postmortem samples where microbial ethanol production could have taken place, irrespectively of the microbes that were possibly activated in the sample.

Η αιθανόλη είναι το βασικό δραστικό συστατικό των αλκοολούχων ποτών και αποτελεί την ευρύτερη νομίμως χρησιμοποιούμενη «ευφοριστική» τοξική ουσία, που χαρακτηρίζεται μάλιστα και από εξαρτησιογόνο δράση. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης αιθανόλης στο αίμα από νεκροτομικό υλικό αποτελεί μέρος της διαδικασίας διερεύνησης των αιτίων θανάτου, δεδομένου ότι η αιθανόλη μπορεί να αποτελεί αιτιώδη παράγοντα που συνέβαλε στον μηχανισμό του θανάτου ενός συγκεκριμένου περιστατικού. Καθίσταται προφανές ότι αν υπάρχει υποψία μικροβιακής παραγωγής αιθανόλης ή αν η προέλευση της προσδιορισθείσας αιθανόλης σε νεκροτομικό υλικό τίθεται υπό αμφισβήτηση (κατάποση «εν ζωή» ή μεταθανάτια μικροβιακή παραγωγή), η ακριβής επιστημονική ερμηνεία των αποτελεσμάτων της ανάλυσης αιθανόλης αποτελεί πρόβλημα κεφαλαιώδους σπουδαιότητας στην Δικαστική Τοξικολογία. Η αιθανόλη μπορεί να βιοσυντεθεί μεταθανάτια από πολλούς μικροοργανισμούς, από όλα τα διαθέσιμα υποστρώματα. Ταυτόχρονα με την αιθανόλη βιοσυντίθενται και άλλες πτητικές ενώσεις, οι λεγόμενες ανώτερες αλκοόλες (1-προπανόλη, 1-βουτανόλη, ισοβουτανόλη, 2-μεθυλο-1-βουτανόλη (d-αμυλική αλκοόλη) και 3-μεθυλο-1-βουτανόλη (ισοαμυλική αλκοόλη)). Σε προηγούμενες μελέτες της επιβλέπουσας της παρούσας διδακτορικής διατριβής, προτάθηκε η διαμόρφωση μαθηματικών μοντέλων για τον υπολογισμό της μικροβιακά παραγόμενης αιθανόλης σε καλλιέργειες των βακτηριακών στελεχών Εscherichia coli, Clostridium perfringens, και Clostridium sporogenes στους 25°C σε συνάρτηση με τις συγκεντρώσεις των αλκοολών 1-προπανόλη, 1-βουτανόλη, ισοβουτανόλη και μεθυλο-βουτανόλη (άθροισμα d-αμυλικής και ισοαμυλικής αλκοόλης). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκαν υγρές αερόβιες/αναερόβιες και αυστηρά αναερόβιες καλλιέργειες, χωριστά, επιλεγμένων μικροβιακών στελεχών (των βακτηρίων Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis και του μύκητα Candida albicans) σε διάφορες θερμοκρασίες (37°C, 25°C και 4°C), με διαφορετικά καλλιεργητικά υλικά (Brain Heart Infusion, BHI (με ή χωρίς προσθήκη επιπλέον γλυκόζης) και Sabouraud Dextrose Broth, SDB), καθώς και αερόβιες/αναερόβιες και αυστηρά αναερόβιες μικροβιακές καλλιέργειες σε μετουσιωμένο ανθρώπινο φυσιολογικό αίμα στους 25°C, σε όξινες ή ουδέτερες συνθήκες pH, με ή χωρίς προσθήκη επιπλέον γλυκόζης. Οι συγκεντρώσεις της αιθανόλης, των ανώτερων αλκοολών και άλλων πτητικών συστατικών που υπάρχουν φυσιολογικά στο ανθρώπινο αίμα ή παράγονται μικροβιακά προσδιορίστηκαν, σε ημερήσια βάση, με αέρια χρωματογραφία υπερκείμενης φάσης και ανιχνευτή ιονισμού φλογός (head space-gas chromatography-flame ionization detector, HS-GC-FID). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με μεθόδους πολυπαραμετρικής ανάλυσης (multiple linear regression) και η συσχέτιση μεταξύ των συγκεντρώσεων των παραγόμενων αλκοολών στις μικροβιακές καλλιέργειες στους 25°C περιγράφηκαν από μαθηματικά μοντέλα. Η εφαρμοσιμότητα των εξαχθέντων μοντέλων ελέγχθηκε στις μικροβιακές καλλιέργειες στους 37°C, στις μικροβιακές καλλιέργειες μετουσιωμένου ανθρώπινου φυσιολογικού αίματος και σε βιολογικά υλικά από πραγματικά περιστατικά νεκροτομών. Η C. albicans παρήγαγε τις υψηλότερες συγκεντρώσεις αιθανόλης στους 25°C και στους 37°C, ακολουθούμενη από την K. pneumoniae, τον S. aureus και τον E. faecalis. Επίσης, παράχθηκαν ανώτερες αλκοόλες και άλλες πτητικές ενώσεις σε συγκεντρώσεις που ποίκιλαν ανάλογα με τις διαφορετικές μικροβιακές καλλιέργειες, τη θερμοκρασία και τη σύσταση των θρεπτικών υλικών. Στις βακτηριακές καλλιέργειες σε ανθρώπινο μετουσιωμένο αίμα, οι υψηλότερες συγκεντρώσεις αιθανόλης παράχθηκαν από την K. pneumoniae μαζί με τον S. aureus και ακολούθως, τον E. faecalis. Οι συγκεντρώσεις αιθανόλης που παρήχθησαν από την C. albicans ήταν ανάλογες της συγκέντρωσης της προστιθέμενης γλυκόζης. Οι ανώτερες αλκοόλες δεν παράχθηκαν από όλες τις μικροβιακές καλλιέργειες σε μετουσιωμένο αίμα. Η 1-προπανόλη, η 1-βουτανόλη, η ισοβουτανόλη και η μεθυλο-βουτανόλη αποτελούν τόσο ποιοτικούς όσο και ποσοτικούς δείκτες της μικροβιακής παραγωγής αιθανόλης. Η 1-προπανόλη ήταν η πιο σημαντική αλκοόλη στη μοντελοποίηση της βακτηριακής παραγωγής αιθανόλης, ενώ η μεθυλο-βουτανόλη η πιο σημαντική αλκοόλη στη μοντελοποίηση της μυκητιακής παραγωγής αιθανόλης. Τα βακτηριακά μοντέλα είχαν καλύτερη εφαρμογή σε δείγματα βακτηριακών καλλιεργειών σε σχέση με τις μυκητιακές καλλιέργειες στους 37°C. Αντιστοίχως, τα μυκητιακά μοντέλα είχαν καλύτερη εφαρμογή σε δείγματα από καλλιέργειες της C. albicans. Τα μοντέλα των βακτηρίων εφαρμόστηκαν με μεγαλύτερη επιτυχία από τα μοντέλα των μυκήτων σε μικροβιακά δείγματα μετουσιωμένου φυσιολογικού αίματος. Αντιθέτως, τα μοντέλα της C. albicans εφαρμόστηκαν κυρίως σε δείγματα από καλλιέργειες μυκήτων σε ανθρώπινο μετουσιωμένο αίμα. Γενικά, τα μοντέλα της K. pneumoniae είχαν την καλύτερη εφαρμογή από όλα τα μικροβιακά μοντέλα, σε δείγματα αίματος από πραγματικά περιστατικά νεκροτομών. Ακολούθησε το μοντέλο του E. faecalis και εκείνα του S. aureus. Τα λιγότερα επιτυχημένα μοντέλα ήταν της C. albicans. Παρατηρήθηκε ότι τα βακτηριακά μοντέλα είχαν καλύτερη εφαρμογή σε μεταθανάτια δείγματα με συγκέντρωση αιθανόλης στο αίμα μεγαλύτερη από 0,50 g/L, σε περιστατικά απροσδιόριστου τρόπου θανάτου παρουσία σήψης. Συνολικά, τα βακτηριακά μοντέλα θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε μεταθανάτια δείγματα ανεξάρτητα από τα μικρόβια που πιθανώς δραστηριοποιούνται στο δείγμα.