Περίληψη
Οι μεταφορείς είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που μεσολαβούν στην επιλεκτική μεταφορά διαλυμένων ουσιών μέσω των βιολογικών κυτταρικών μεμβρανών. Η οικογένεια Nucleobase Cation Symporter 1 (NCS1) που συναντάται σε προκαρυωτικούς οργανισμούς, μύκητες και ορισμένα φυτά, είναι ειδική για τις νουκλεοβάσεις. Η οικογένεια NCS1 απουσιάζει στα θηλαστικά και έτσι γίνεται ένας πολλά υποσχόμενος στόχος για αντιμικροβιακά φάρμακα. Επιπροσθέτως, αρκετοί ανθρώπινοι μεταφορείς (π.χ. μεταφορείς νευροδιαβιβαστών σεροτονίνης και ντοπαμίνης) σημαντικοί από βιολογική σκοπιά, έχουν την ίδια αναδίπλωση με τους μεταφορείς NCS1, ανοίγοντας το δρόμο για νέες γνώσεις σχετικά με την ανάπτυξη αντικαταθλιπτικών φαρμάκων και κατανόησης του μηχανισμού δράσης τους. Μια οικογένεια ειδική για νουκλεοβάσεις, διακριτή φυλογενετικά και δομικά, γνωστή ως Nucleobase Ascorbate Transporter (NAT) ή οικογένεια NCS2, υπάρχει σε βακτήρια, μύκητες, φυτά και μετάζωα, αλλά και σε ανώτερα πρωτεύοντα, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, ...
Οι μεταφορείς είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που μεσολαβούν στην επιλεκτική μεταφορά διαλυμένων ουσιών μέσω των βιολογικών κυτταρικών μεμβρανών. Η οικογένεια Nucleobase Cation Symporter 1 (NCS1) που συναντάται σε προκαρυωτικούς οργανισμούς, μύκητες και ορισμένα φυτά, είναι ειδική για τις νουκλεοβάσεις. Η οικογένεια NCS1 απουσιάζει στα θηλαστικά και έτσι γίνεται ένας πολλά υποσχόμενος στόχος για αντιμικροβιακά φάρμακα. Επιπροσθέτως, αρκετοί ανθρώπινοι μεταφορείς (π.χ. μεταφορείς νευροδιαβιβαστών σεροτονίνης και ντοπαμίνης) σημαντικοί από βιολογική σκοπιά, έχουν την ίδια αναδίπλωση με τους μεταφορείς NCS1, ανοίγοντας το δρόμο για νέες γνώσεις σχετικά με την ανάπτυξη αντικαταθλιπτικών φαρμάκων και κατανόησης του μηχανισμού δράσης τους. Μια οικογένεια ειδική για νουκλεοβάσεις, διακριτή φυλογενετικά και δομικά, γνωστή ως Nucleobase Ascorbate Transporter (NAT) ή οικογένεια NCS2, υπάρχει σε βακτήρια, μύκητες, φυτά και μετάζωα, αλλά και σε ανώτερα πρωτεύοντα, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, όπου ορισμένα ομόλογα είναι ειδικά για L-ασκορβικό οξύ αντί για νουκλεοβάσεις. Ως εκ τούτου, ο δομικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός των συστημάτων NCS1 και NAT/NCS2 αναδεικνύεται ως ένα σημαντικό πρώτο βήμα για μια επιτυχημένη διαδικασία σχεδιασμού φαρμάκων. Αν και υπάρχουν πολλά γενετικά, βιοχημικά και ορισμένα δομικά δεδομένα, λιγότερα είναι γνωστά για τον μηχανισμό μεταφοράς και την ειδικότητα τους. Αυτό είναι συνέπεια της δυσκολίας κρυστάλλωσης ή εκτέλεσης cryo-ΕΜ σε πολυτοπικά διαμεμβρανικά συστήματα με πολλαπλές διαμορφώσεις και των εξαιρετικά εκτενών υπολογιστικών προσεγγίσεων που απαιτούνται για τη θεωρητική περιγραφή τους. Ωστόσο, λίγα μέλη αυτών των οικογενειών έχουν κρυσταλλωθεί, υποδεικνύοντας έναν μηχανισμό εναλλασσόμενης πρόσβασης, σύμφωνα με τον οποίο ο μεταφορέας υφίσταται μεγάλες διαμορφωτικές αλλαγές για να αναγνωρίσει, να δεσμεύσει και να απελευθερώσει το υπόστρωμα κατά μήκος της μεμβράνης. Είναι αξιοσημείωτο ότι όλοι οι μεταφορείς NCS1 και NAT/NCS2 λειτουργούν ως συμμεταφορείς H+ ή Na+. Στην περίπτωση των ΝΑΤ, 14 διαμεμβρανικά τμήματα (TMS) αναδιπλώνονται σε μια ανεστραμμένη επανάληψη 7 ελίκων (7+7). Οι κρυσταλλικές δομές έχουν ληφθεί από δύο μέλη των ΝΑΤ, τον μεταφορέα ουρακίλης UraA του Ε. coli και τον μεταφορέα UapA ουρικού οξέος-ξανθίνης του Α. nidulans, και αποτελούνται από έναν τομέα πυρήνα και έναν τομέα διμερισμού και λειτουργούν ως διμερή. Ο μηχανισμός λειτουργείας τους θεωρείται πως είναι ο λεγόμενος «μηχανισμός ανελκυστήρα». Οι μεταφορείς NCS1, αποτελούνται από 12 TMS αναδιπλωμένα σε μια ανεστραμμένη επανάληψη 5 ελίκων (5+5), ακολουθούμενα από δύο TMS που δεν έχουν άμεσο ρόλο στη μεταφορά του υποστρώματος. Αυτή η αναδίπλωση είναι χαρακτηριστική για όλους τους μεταφορείς της υπεροικογένειας APC, με κύριους κρυσταλλωμένους εκπροσώπους τον μεταφορέα υδαντοΐνης Mhp1, τον μεταφορέα λευκίνης LeuT, τον μεταφορέα ντοπαμίνης DAT και τον μεταφορέα σεροτονίνης SERT. Όλοι οι NCS1 μεταφορείς, λειτουργούν με τον μηχανισμό «rocking-bundle».Η παρούσα μελέτη αποτελείται από τέσσερα μέρη. Στο πρώτο μέρος αποκαλύπτουμε τον τρόπο δέσμευσης, μετατόπισης και απελευθέρωσης της ουρακίλης και του Η+ από τον εξωκυττάριο χώρο στο κυτταρόπλασμα του μεταφορέα FurE (NCS1), χρησιμοποιώντας νέες προσομοιώσεις Μεταδυναμικής και ορθολογικά σχεδιασμένες μεταλλάξεις. Συγκεκριμένα, τα διαγράμματα της Επιφανείας Ελεύθερης Ενέργειας που προκύπτουν από τη Μεταδυναμική (FES), παρέχουν τη σχετική σειρά μεταφοράς της ουρακίλης και του πρωτονίου, επιτρέποντας επίσης την επιλογή ενδιάμεσων διαμορφώσεων, που σχετίζονται με τον κύκλο μεταφοράς. Η μεταδυναμική με χρήση περιοριστικής χοάνης (Funnel-Metadynamics), επιτρέπει δειγματοληψία αφενός των μονοπατιών που ακολουθεί το υπόστρωμα προκειμένου να συνδεθεί στη θέση πρόσδεσης και αφετέρου των τρόπων σύνδεσης της ουρακίλης και του πρωτονίου, δημιουργώντας ένα ολιστικό μοντέλο των γεγονότων που διέπουν τη μεταφορά υποστρώματος και που υποστηρίζονται από μελέτες μεταλλάξεων. Η εργασία μας όχι μόνο επεκτείνει τις υπάρχουσες γνώσεις σχετικά με τους μεταφορείς με τεταρτοταγή δομή τύπου FurE (LeuT, DAT, SERT, NET), αλλά επιβεβαιώνει για πρώτη φορά για ένα συμμεταφορέα πρωτονίων, τον λεγόμενο «rocking-bundle» μηχανισμό.Στο δεύτερο μέρος, παρουσιάζουμε τα 3 μοντέλα του μεταφορέα UapA που κατασκευάστηκαν με χρήση Στοχευμένων Μοριακών Δυναμικών (Targeted Molecular Dynamics) και Μοντέλων Ομολογίας (Homology Modeling), σε διαφορετικές διαμορφώσεις, συνθέτοντας μαζί με την κρυσταλλική δομή τη διαμορφωτική αλλαγή που ακολουθείται κατά τον μηχανισμό του ανελκυστήρα. Επιπλέον, εφαρμόζουμε Μεταδυναμική και αναδεικνύουμε σημαντικές πληροφορίες για τις διαμορφώσεις Inward-Open και Occluded, ενώ αποκαλύπτουμε την ασύγχρονη κίνηση των δύο πρωτομερών του διμερούς. Τέλος, περιγράφουμε τη συμβολή βασικών αμινοξέων στον μηχανισμό του ανελκυστήρα και στη μεταφορά του υποστρώματος. Στο τρίτο μέρος, διερευνούμε τον ρόλο του συντηρημένου μοτίβου NAT του UapA χρησιμοποιώντας μελέτες Επαγόμενης Πρόσδεσης (Induced Fit Docking), μεθόδους υπολογισμού Ελεύθερης Ενέργειας (Free Energy Methods) και ανάλυση μεταλλάξεων. Επιπλέον, προσφέρουμε νέα ευρήματα σχετικά με τον βασικό ρόλο του F528, ενός καταλοίπου εκτός της θέσης δέσμευσης του υποστρώματος, το οποίο φαίνεται να ρυθμίζει την εξειδίκευση του UapA.Στο τέταρτο μέρος, εξετάζουμε τις σχέσεις δομής-λειτουργίας των βακτηριακών μεταφορέων SmLL9, XanQ και AncXanQ της οικογένειας NAT, χρησιμοποιώντας Μοριακές Δυναμικές (Molecular Dynamics), Μελέτες Επαγώμενης Πρόσδεσης (Induced Fit Docking) και μεταλλαξιγέννεσης (site-directed mutagenesis), δίνοντας σημαντικά αποτελέσματα όσον αφορά την εξειδίκευση των μεταφορέων αυτών για τα υποστρώματα. Υπογραμμίζεται επίσης ο απροσδόκητα σημαντικός ρόλος των αμινοξέων εκτός της θέσης δέσμευσης στην εξειδίκευση, παρεμβαίνοντας στον μηχανισμό ολίσθησης του μεταφορέα.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Transporters are transmembrane proteins mediating the selective transport of solutes across the biological cell membranes. The Nucleobase Cation Symporter 1 (NCS1) family encountered in prokaryotes, fungi, and some plants is specific for nucleobases. The NCS1 family is absent in mammals and thus becomes a promising target for antimicrobial drugs. In addition, several biomedically important human transporters (e.g., serotonin and dopamine neurotransmitter transporters) have the same fold as NCS1 transporters, paving the way to new knowledge concerning the development of antidepressant drugs and understand their mechanism of action. A phylogenetically and structurally distinct nucleobase-specific family, known as Nucleobase Ascorbate Transporter (NAT) or NCS2 family is ubiquitously present in bacteria, fungi, plants and metazoa, and interestingly and in higher primates, including humans, some homologues are specific for L-ascorbic acid rather than nucleobases. Therefore, the structural a ...
Transporters are transmembrane proteins mediating the selective transport of solutes across the biological cell membranes. The Nucleobase Cation Symporter 1 (NCS1) family encountered in prokaryotes, fungi, and some plants is specific for nucleobases. The NCS1 family is absent in mammals and thus becomes a promising target for antimicrobial drugs. In addition, several biomedically important human transporters (e.g., serotonin and dopamine neurotransmitter transporters) have the same fold as NCS1 transporters, paving the way to new knowledge concerning the development of antidepressant drugs and understand their mechanism of action. A phylogenetically and structurally distinct nucleobase-specific family, known as Nucleobase Ascorbate Transporter (NAT) or NCS2 family is ubiquitously present in bacteria, fungi, plants and metazoa, and interestingly and in higher primates, including humans, some homologues are specific for L-ascorbic acid rather than nucleobases. Therefore, the structural and functional characterization of the NCS1 and NAT/NCS2 systems emerges as an important first step to a successful drug design process. Although there is plenty of genetic, biochemical and some structural data, less is known about their transport mechanism, and their selectivity. This is a consequence of the difficulty in crystallizing or performing cryo-EM of polytopic transmembrane systems in multiple conformations and the demanding computational approaches needed to theoretically describe them. However, few members of these families have been crystallized indicating an alternate-access mechanism, according to which the transporter undergoes large conformational rearrangements to recognize, bind and release the substrate across the membrane. Noticeably, NCS1 and NAT/NCS2 all transporters function as H+ or Na+ symporters. In the case of NATs, 14 transmembrane segments (TMSs) are folded in a 7-helix inverted repeat (7+7). Crystal structures have been obtained from two NAT members, the UraA uracil transporter of E. coli and the UapA uric acid-xanthine transporter of A. nidulans, which form a core and a dimerization domain, and function as dimers. They are considered to operate under the so-called “elevator-mechanism”. NCS1 transporters, consist of 12 TMSs folded in a 5-helix inverted repeat (5+5), followed by two TMS that do not have a direct role in transport activity. This fold is characteristic of all APC superfamily transporters, with main crystallized representatives the Mhp1 hydantoin transporter, the LeuT leucine transporter, the DAT dopamine transporter, and the SERT serotonin transporter. All NCS1 operate under the “rocking-bundle” mechanism.The present study consists of four parts. In the first part we reveal the binding mode, translocation, and release pathway of uracil/H+ from the extracellular space to the cytoplasm of the NCS1 FurE transporter, using novel Metadynamics simulations and rationally designed mutational analysis. In particular, Metadynamics Free Energy Surface maps provide the relative order of internalization of the uracil and the proton, permitting also the selection of intermediate conformational states related to the transport cycle. Funnel Metadynamics allow the sampling of the binding pathway and modes of both uracil and proton, generating a holistic model of the transport events supported by mutation studies. Our work not only extends the existing knowledge on FurE same-fold transporters, namely LeuT, DAT, SERT, NET, but also confirms for the first time for a proton symporter, the so-called rocking-bundle mechanism.In the second part, we present the 3 models of UapA constructed using Targeted Molecular Dynamics and Homology Modeling, in different conformations, synthesizing along with the crystal structure the elevator-mechanism path. Furthermore, we apply Metadynamics and indicate important information about the Inward-Open and Occluded conformations, while revealing the asynchronous movement of the two protomers of the dimer. Finally, we describe the contribution of key residues in the elevator mechanism and substrate transport.In the third part, we investigate the role of the NAT signature motif of UapA using Induced Fit Docking, Free Energy Methods and mutational analysis. Additionally, we offer novel findings regarding the key role of F528, a residue outside the substrate binding site, which seems to regulate UapA specificity.In the fourth part, we address the structure-function relationships of the bacterial NAT transporters SmLL9, XanQ and AncXanQ, using Molecular Dynamics, Induced Fit Docking and site-directed mutagenesis, conducting important results regarding specificity. The unexpected role of residues outside the binding site to specificity, by interfering to the transporter’s sliding mechanism is also underlined.
περισσότερα