Dissection of intrinsic and extrinsic factors contributing to cancer growth in a fly brain tumour model

Abstract

Brain tumors (e.g. Glioblastomas) are very aggressive tumors with poor prognosis which are characterized by genetic and epigenetic diversity, making the development of therapies that eliminate all tumor cells challenging and currently impossible. Cancer Stem Cells, major components of brain tumors, are tumorigenic stem-cell like cells with self-renewing capacity which maintain tumor growth. Additionally, interactions of the tumor with its microenvironment shape tumor progression. Drosophila has proven a valuable tool when it comes to modeling basic molecular mechanisms which are deregulated in human diseases.In Drosophila, similar to the mammalian systems, brain development is achieved by asymmetric cell divisions of neural stem cells (NSCs) which self-renew to produce a cell with stem cell identity and also generate progeny that is routed to differentiation. Previous work in the lab has shown that Notch signaling in the developing brain tightly regulates the differentiation status of neural lineages with NSCs receiving Notch signal from their progeny. Notch induces the expression of HES proteins which repress the expression of differentiation genes, thus ensuring stem cell maintenance. Genetic insults, such as excess of Notch signaling, perturb the normal NSC proliferation programs and trigger the formation of NSC hyperplasias at the expense of differentiated neuronal progeny.During my Ph.D., I showed that neural stem cell hyperplasias induced by Notch or HES overexpression are prone to malignant overgrowth and metastasis to distant sites upon allografting to an adult fly host. I investigated whether loss of HES genes has an impact on the malignant potential of Notch induced hyperplasias and I showed that the E(spl) genes (which belong to HES family) are important mediators in the progression to malignancy. I also performed transcriptomic analysis of Notch and HES induced tumors at different stages of tumor progression. This analysis revealed that both types of NSC-derived tumors, whether triggered by Notch or by HES, are quite similar and retain stem cell characteristics, while differentiation-promoting transcription factors are downregulated. This is accompanied by an upregulation of stress-response genes, growth control genes and metabolic reprogramming. An interesting finding of the transcriptomic analysis was the de novo expression of immunity genes in the allografts, which, together with immunohistochemistry, revealed the attraction of hemocytes (Drosophila blood cells) to the allografted tumor.I was intrigued by this finding and tried to assess the functional role of host hemocytes in tumor progression. By genetic manipulation of host hemocytes, fixed and live imaging experiments we showed that hemocytes impede tumor growth by associating with tumor cells and performing phagocytosis. I also performed an RNAi screen in host hemocytes by knocking down factors related to phagocytosis, ROS production and hemocyte migration. The screen revealed that loss of phagocytic receptors in hemocytes accelerates allograft tumor growth while perturbing ROS production results in slower tumor expansion, suggesting that phagocytosis restricts tumor growth whereas hemocyte ROS production accelerates it. The Drosophila respiratory system (trachea) was also found to associate with tumor cells in the fly host. I therefore, investigated whether this association impacts tumor growth and showed that integrity of the trachea might contribute to tumor suppression, although more experiments are needed to substantiate this model.

Οι όγκοι του εγκεφάλου, όπως είναι το γλοιοβλάστωμα, διακρίνονται για την επιθετικότητά τους και συνεπώς την κακή πρόγνωση των ασθενών. Χαρακτηρίζονται από γενετική και επιγενετική ποικιλομορφία, η οποία σε συνδυσμό με την αλληλεπίδραση του όγκου με το μικροπεριβάλλον του, καθιστούν την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών πολύπλοκη και προς το παρόν αδύνατη.Η Drosophila melanogaster αποτελεί ένα χρήσιμο οργανισμό-μοντέλο για την έρευνα βασικών μοριακών μηχανισμών που συντελούν στην ανάπτυξη ανθρώπινων ασθενειών. Στα θηλαστικά, όπως και στην Drosophila, η ανάπτυξη του εγκεφάλου επιτυγχάνεται από ασύμμετρες διαιρέσεις στον νευρικών βλαστοκυττάρων. Τα βλαστοκύτταρα (ή αλλιώς νευροβλάστες) διαιρούνται παράγοντας κύτταρα με ιδιότητες βλαστοκύτταρου (αυτό-ανανέωση) αλλά και κύτταρα που προορίζονται για διαφοροποίηση. Προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριο έδειξαν ότι η σηματοδότηση Notch στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο της Drosophila ρυθμίζει τη διαφοροποίηση των νευρικών γενεαλογιών, με τα βλαστοκύτταρα να δέχονται σήματα ενεργοποίησης του μονοπατιού από τους ίδιους τους τους απογόνους. Η ενεργοποίηση αυτή επάγει την έκφραση των πρωτεϊνών HES που, όντας μεταγραφικοί καταστολείς, μειώνουν την έκφραση γονιδίων διαφοροποίησης εξασφαλίζοντας την βλαστική τύχη. Γενετικές τροποποιήσεις όπως η υπερ-ενεργοποίηση του Notch μονοπατιού ή η υπερέκφραση των HES γονιδίων διαταράσσουν τα προγράμματα κυτταρικής τύχης, παράγοντας υπεράριθμα βλαστοκύτταρα σε βάρος των νευρικών κυττάρων και δημιουργώντας υπερπλασίες στο νευρικό σύστημα.Κατά τη διάρκεια της διδακτορικής μου διατριβής έδειξα ότι αυτές οι υπερπλασίες που δημιουργούνται στον εγκέφαλο της προνύμφης είναι κακοήθεις. Η κακοήθεια στη Drosophila ορίζεται από τη δυνατότητα ενός υπερπλαστικού ιστού να πολλαπλασιάζεται ανεξέλεγκτα, να κάνει μεταστάσεις όταν μεταμοσχεύεται σε μία ενήλικη μύγα-δέκτη και να προκαλεί τον πρόωρο θάνατό της. Ερεύνησα την αναγκαιότητα των HES πρωτεϊνών στην κακοήθη συμπεριφορά του όγκου που προκαλείται από υπερ-ενεργοποίηση του Notch μονοπατιού. Έδειξα ότι τα E(spl) γονίδια, που ανήκουν στην οικογένεια των HES πρωτεϊνών, παίζουν καθοριστικό ρόλο στην εμφάνιση του κακοήθους φαινοτύπου. Με διαδοχικές μεταμοσχεύσεις του καρκινικού ιστού είναι δυνατό να μελετήσουμε διαφορετικά στάδια εξέλιξης του όγκου. Σε τρία διαφορετικά στάδια έγινε μεταγραφωματική ανάλυση σε όγκους που δημιουργούνται είτε από υπερ-ενεργοποίηση του Notch μονοπατιού είτε από υπερέκφραση τον HES πρωτεϊνών. Η ανάλυση αυτή έδειξε ότι οι δύο τύποι καρκίνου είναι παρόμοιοι μεταξύ τους, διατηρώντας σε υψηλά επίπεδα έκφρασης χαρακτηριστικά βλαστοκυττάρων, ενώ μεταγραφικοί παράγοντες που προωθούν τη διαφοροποίηση παρουσιάζουν μειωμένη έκφραση καθώς ο όγκος εξελίσσεται. Επιπλέον παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση σε γονίδια που σχετίζονται με την απόκριση σε στρες, τον έλεγχο της αύξησης και τον μεταβολισμό. Ένα ενδιαφέρον εύρημα που προέκυψε από την ανάλυση ήταν η εκ νέου έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ανοσολογική απόκριση στους μεταμοσχευμένους ιστούς. Σε συνδυασμό με ανοσοϊστοχημικές χρώσεις, έδειξα ότι κατά τη μεταμόσχευση, κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος του ξενιστή (αιμοκύτταρα στη Drosophila) προσελκύονται στο μόσχευμα.Το εύρημα αυτό με ώθησε να μελετήσω τον ρόλο τον αιμοκυττάρων στην εξέλιξη του όγκου. Χρησιμοποιώντας γενετικούς χειρισμούς στα αιμοκύτταρα της μύγας-ξενιστή και κάνοντας πειράματα σε μονιμοποιημενους ιστούς ή σε πραγματικό χρόνο (live imaging) έδειξα ότι τα αιμοκύτταρα καταστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου μέσω φαγοκυττάρωσης. Επιπλέον, διεξήγαγα μια μελέτη με παρεμβολή RNA (RNAi screen) κατά την οποία μειώθηκε η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη φαγοκυττάρωση, την παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου (ROS) και τη μετανάστευση των αιμοκυττάρων του ξενιστή. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η έλλειψη υποδοχέων φαγοκυττάρωσης στα αιμοκύτταρα επιταχύνει την ανάπτυξη του όγκου οδηγώντας σε πρόωρο θάνατο. Αντίθετα, η μειωμένη παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου από τα αιμοκύτταρα περιόρισε την ανάπτυξη του όγκου, υποδεικνύοντας ότι ο μηχανισμός αυτός ίσως συμβάλλει στην εξάπλωσή του. Τέλος, το αναπνευστικό σύστημα της μύγας-ξενιστή (τραχεία) φάνηκε να αλληλεπιδρά με τα καρκινικά κύτταρα και δείξαμε ότι αυτή η αλληλεπίδραση έχει πιθανώς κατασταλτικο ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου, αν και θα χρειαστούν περισσότερες μελέτες για την εδραίωση αυτού του μοντέλου.