Laser based micro- and nano- structured Si surfaces for neural tissue engineering

Abstract

Peripheral nerve injury causes significant morbidity, has an important impact on patients' sensory activity and significantly deteriorates their quality of life. Albeit the spontaneous regeneration potential of the peripheral nervous system (PNS), the repair is almost always incomplete and with limited functional recovery. In order to achieve full recovery of the injured peripheral nerves, the use of autologous nerve grafts is the golden standard since decades. However, this approach involves several drawbacks, such as morbidity at the donor site, limited availability of grafts and more importantly it rarely leads to the full recovery of the patient. As a response to these limitations, neural tissue engineering (NTE) has emerged as an alternative approach, aiming at the restoration of lost or damaged neural tissue with the use of cells.NTE encompasses the development of appropriate scaffolds for the growth of regenerated tissues. The natural environment of the cells is the extracellular matrix (ECM), a complex environment that provides the mechanical framework to enable cell growth, intercellular interaction and tissue formation. During the development of the nervous system, the ECM significantly contributes to the maturation of neurons and neurites via its surface topography and microenvironment signals. Consequently, the scaffolds used in NTE play a very important role, as their topography can affect vital functions of the cells, such as their attachment, proliferation, morphology, migration and differentiation.A large variety of fabrication methods and materials have been used for the development of scaffolds for NTE applications. Here, we fabricated micro- and nano- patterned Si substrates via direct ultra-fast laser irradiation. The aim of the study was to develop substrates that enable spatial patterning of the PNS cells in a controllable manner and to explore if and how the underlying topography can lead to controlled cellular growth and differentiation. The ultimate goal was to exploit the semiconducting properties of Si in a selective patterning cell culture substrate which could allow the recording of neuronal signals. In order to achieve this goal, two separate steps were indispensable: 1. the development of a culture substrate that would support the selective and controlled cellular adhesion, and 2. the successful differentiation of the neuronal cells on it. With this aim, Si was irradiated in different environments (reactive gas atmosphere, vacuum and aqueous environment). Si irradiation with low laser fluence in vacuum and water resulted in the development of different nano-topographies. By increasing laser fluence, three types of micro-cones were formed, i.e low, medium and high roughness micro-cones, fabricated both with linear and circular laser polarization. The resulting micro-cones have been tested with in vitro cell cultures before selecting the micro-cones fabricated with linearly polarized light to proceed to the development of the combined nano-rippled and micro-coned (NR-MC) Si substrate. After considering nano-topographies formed in Si with low laser fluence in both vacuum and water, the nano-ripples fabricated in water were selected for the NR-MC substrates. The combination of two different size-scales (micro-cones and nano-ripples) in a single substrate led to the development of a spatial platform with different pseudoperiodic morphologies. The developed substrates were characterized regarding surface morphology and wetting properties and were then used as cell culture substrates in vitro.The cell models used included mono-cultures of NIH 3T3 fibroblasts cells, glial cells (Schwann – SW10), and neuronal-like cells (neuro2a – N2a), as well as co-cultures of SW10 and N2a cells. NIH 3T3 cells were used as a well-studied experimental model for cellular functions, in order to test some basic parameters of the experiment, such as cell survival and cell density. SW10 and N2a cells were used as the glia and the neuronal-like cells of the PNS and their co-culture was attempted because it can better simulate its actual structure. The cell growth was assessed on the different topographies in comparison to flat Si control surfaces. The neuronal cell adhesion behavior and differentiation was correlated to the underlying topography and to the presence of glia.Our results show that by implementing the NR-MC combined topography, the synergistic role of the glial and neuronal-like cells is impelled and the area where the N2a cells grow can be controlled. The presence of the glial cells (SW10) influences the adhesion of the neuronal-like cells (N2a). When they are co-seeded on the Si scaffolds, the N2a cells adhere on top of the oriented Schwann cells and only on the areas where the Schwann cells adhere. Therefore, the characteristics of the NR-MC Si surfaces can influence the neural cell growth. The NR-MC topography could then be designed to comprise predefined areas that can either promote or inhibit neural cell adhesion and network formation, depending on the therapeutical needs.Moreover, Si nano- and micro- structures were used as culture platforms to evaluate the effect of the topography on neuronal differentiation, both in a mono-culture and in a co-culture with glial cells. The topography of the Si substrates was found to impede the N2a differentiation even in the presence of a differentiation medium. More specifically, the higher the roughness, the more limited the differentiation was. The same conclusion is also valid for the differentiation of N2a cells in a co-culture with SW10 cells, i.e. the N2a differentiation is inhibited as the substrate becomes rougher. We can therefore conclude that the presence of glia has the potential to change the adhesion behaviour of the neuronal-like cells, but the ability to differentiate does not alter. This implies that concerning neuronal differentiation, the topography plays a more important role than the synergetic role of the glia. Further investigation via protein screening methods can shed light on cell mechanotransduction, paving the way towards the understanding of how cells translate these stimuli into biochemical signals that control the differentiation.

Οι τραυματισμοί του περιφερικού νευρικού συστήματος προκαλούν νοσηρότητα, περιορίζουν τις αισθητηριακές ικανότητες των ασθενών και έχουν σημαντικό αντίκτυπο στην ποιότητα ζωής τους. Παρά την αυθόρμητη ικανότητα αναγέννησης του περιφερικού νευρικού συστήματος, η επιδιόρθωση που επιτυγχάνεται είναι σχεδόν πάντα ατελής και με περιορισμένη λειτουργικότητα. Για να επιτευχθεί πλήρης ίαση των τραυματισμένων περιφερικών νεύρων, η χρήση αυτόλογων νευρικών μοσχευμάτων αποτελεί τον χρυσό κανόνα εδώ και δεκαετίες. Ωστόσο, αυτή η προσέγγιση εμπεριέχει πολλά μειονεκτήματα, όπως η νοσηρότητα στο σημείο λήψης του μοσχεύματος, η περιορισμένη διαθεσιμότητα μοσχευμάτων και το πιο σημαντικό, σπάνια επιτυγχάνεται η πλήρης ίαση του/της ασθενούς. Σαν απάντηση σε αυτούς τους περιορισμούς, η μηχανική νευρικών ιστών έχει προκύψει ως μια εναλλακτική προσέγγιση που στοχεύει στην ανάπλαση του τραυματισμένου νευρικού ιστού με τη χρήση κυττάρων.Η κατασκευή των ικριωμάτων, όπου θα πραγματοποιηθεί η ανάπτυξη των αναγεννώμενων ιστών, είναι ένα σημαντικό πεδίο έρευνας στη μηχανική νευρικών ιστών. Το φυσικό περιβάλλον των κυττάρων είναι ο εξωκυττάριος χώρος, ένα σύνθετο περιβάλλον που παρέχει τα κατάλληλα μηχανικά σήματα για να επιτρέψει την ανάπτυξη των κυττάρων, την ενδοκυττάρια αλληλεπίδραση και τη διαμόρφωση των ιστών. Κατά την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος, ο εξωκυττάριος χώρος επιδρά σημαντικά στην ωρίμανση των νευρώνων και των νευριτών, μέσω της επιφανειακής του τοπογραφίας και των μηχανικών σημάτων του μικρο-περιβάλλοντός του. Συνεπώς, η τοπογραφία των ικριωμάτων που χρησιμοποιούνται στη μηχανική νευρικών ιστών παίζει πολύ σημαντικό ρόλο, καθώς μπορεί να επηρεάσει ζωτικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η προσκόλληση, ο πολλαπλασιασμός, η μορφολογία, η μετανάστευση και η διαφοροποίηση.Πολλές διαφορετικές μέθοδοι κατασκευής, αλλά και μεγάλη ποικιλία υλικών, έχει χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη ικριωμάτων για εφαρμογές μηχανικής νευρικών ιστών. Εδώ, κατασκευάσαμε μικρο- και νανο- δομημένες επιφάνειες πυριτίου μέσω ακτινοβόλησης με λέιζερ υπέρ-στενών παλμών. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν η ανάπτυξη υποστρωμάτων που θα επέτρεπαν την ελεγχόμενη ανάπτυξη των κυττάρων του περιφερικού νευρικού συστήματος. Ακόμα, η απάντηση στο ερώτημα κατά πόσον η τοπογραφία του υποστρώματος μπορεί να οδηγήσει σε ελεγχόμενη κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Ο απώτερος στόχος ήταν η καταγραφή νευρικών σημάτων μέσω του ημιαγώγιμου υποστρώματος του πυριτίου. Για να επιτευχθεί αυτός ο στόχος ήταν απαραίτητη αρχικά: 1. η κατασκευή ενός υποστρώματος που θα υποστήριζε την επιλεκτική και ελεγχόμενη κυτταρική προσκόλληση, και στη συνέχεια 2. η επιτυχής διαφοροποίηση των κυττάρων σε αυτό το υπόστρωμα.Για τον σκοπό αυτό, πυρίτιο ακτινοβολήθηκε σε διαφορετικά περιβάλλοντα (σε αντιδραστικό αέριο, σε κενό και σε νερό). Η ακτινοβόληση του πυριτίου με χαμηλή πυκνότητα ενέργειας σε κενό και σε νερό οδήγησε στον σχηματισμό νανο-κυματισμών με διαφορετική περιοδικότητα, ανάλογα με το περιβάλλον ακτινοβόλησης. Αυξάνοντας την πυκνότητα ενέργειας και σε περιβάλλον αντιδραστικού αερίου, κατασκευάστηκαν τρεις τύποι μικρο-κώνων (χαμηλής, μεσαίας και υψηλής τραχύτητας). Οι κώνοι αυτοί κατασκευάστηκαν τόσο με γραμμική, όσο και με κυκλική πόλωση του λέιζερ, και χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα in vitro κυτταροκαλλιεργειών. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν οι μικρο-κώνοι που κατασκευάστηκαν με γραμμική πόλωση και οι νανο-κυματισμοί που κατασκευάστηκαν σε νερό για τη δημιουργία ενός συνδυαστικού υποστρώματος με νάνο- και μίκρο- δομές. Ο συνδυασμός δύο διαφορετικών τάξεων μεγέθους (μικρο-κώνων και νανο-κυματισμών) σε ένα υπόστρωμα οδήγησε στη δημιουργία μιας χωρικής πλατφόρμας με διαφορετικές ψευδο-περιοδικές δομές. Τα υποστρώματα αυτά χαρακτηρίστηκαν ως προς τη μορφολογία της επιφάνειάς τους και τις ικανότητες διαβροχής τους και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα για την καλλιέργεια κυττάρων του περιφερικού νευρικού συστήματος in vitro. Πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες ενός είδους κυττάρων (μονο-καλλιέργειες) ινοβλαστών NIH 3T3, γλοιακών κυττάρων (Schwann – SW10) και κυττάρων που προσομοιάζουν σε νευρικά (neuro2a – N2a). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν συγκαλλιέργειες κυττάρων SW10 και N2a. Οι ινοβλάστες NIH 3T3 χρησιμοποιήθηκαν αρχικά ως ένα καλά μελετημένο πειραματικό μοντέλο για να μελετηθούν κάποιες βασικές παράμετροι του πειράματος, όπως η επιβίωση των κυττάρων και η πυκνότητά τους. Τα SW10 και N2a κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν σαν τα γλοία και τους νευρώνες του περιφερικού νευρικού συστήματος αντίστοιχα. Η συγκαλλιέργειά τους πραγματοποιήθηκε ως πιο ακριβές μοντέλο για τη μελέτη του περιφερικού νευρικού συστήματος, καθώς η συνύπαρξη τόσο των γλοιακών κυττάρων, όσο και αυτών προσομοιάζουν σε νευρικά, ανταποκρίνεται καλύτερα στην πραγματική δομή του περιφερικού νευρικού συστήματος. Η ανάπτυξη των κυττάρων αξιολογήθηκε στις διαφορετικές δομημένες επιφάνειες σε σύγκριση με την επίπεδη επιφάνεια πυριτίου. Η προσκόλληση και η διαφοροποίηση των νευρικών κυττάρων μελετήθηκε σε σχέση με την τοπογραφία του υποστρώματος καλλιέργειας και με την παρουσία γλοιακών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η χρήση της συνδυασμένης μίκρο- και νάνο- τοπογραφίας, οδηγεί σε ελεγχόμενη προσκόλληση των κυττάρων. Η παρουσία των γλοιακών κυττάρων (SW10) επηρεάζει την προσκόλληση των κυττάρων που προσομοιάζουν σε νευρώνες (N2a). Συγκεκριμένα, στην συγκαλλιέργεια στα δομημένα υποστρώματα πυριτίου, τα N2a προσκολλώνται πάνω από τα προσανατολισμένα κύτταρα Schwann και μόνο στις περιοχές όπου προσκολλώνται τα Schwann. Συνεπώς, τα τοπογραφικά χαρακτηριστικά των συνδυαστικών υποστρωμάτων πυριτίου μπορούν να επηρεάσουν την ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων και η συνδυαστική τοπογραφία μπορεί να σχεδιαστεί έτσι ώστε να περιέχει προκαθορισμένες περιοχές που να ευνοούν ή να εμποδίζουν την προσκόλληση των νευρικών κυττάρων, ανάλογα με τις θεραπευτικές ανάγκες. Ακόμα, οι νάνο- και μίκρο- δομημένες επιφάνειες πυριτίου χρησιμοποιήθηκαν ως πλατφόρμες για την μελέτη της επίδρασης της τοπογραφίας στη διαφοροποίηση των N2a κυττάρων, τόσο σε μονο-καλλιέργεια, όσο και σε συγκαλλιέργεια με γλοιακά κύτταρα. Βρέθηκε ότι η τοπογραφία των υποστρωμάτων εμποδίζει τη διαφοροποίηση, παρά τη χρήση χημικών μέσων που επάγουν τη διαφοροποίηση. Πιο συγκεκριμένα, όσο αυξάνεται η τραχύτητα του υποστρώματος, τόσο περιορίζεται η διαφοροποίηση των N2a κυττάρων. Το ίδιο ισχύει και για τη διαφοροποίηση των N2a σε συγκαλλιέργεια με τα SW10, δηλαδή και σε αυτήν την περίπτωση όσο αυξάνει η τραχύτητα του υποστρώματος, τόσο η διαφοροποίηση περιορίζεται. Άρα, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι παρόλο που η παρουσία των γλοιακών κυττάρων έχει τη δυνατότητα να επηρεάζει την προσκόλληση των κυττάρων που προσομοιάζουν σε νευρώνες, η ικανότητά τους προς διαφοροποίηση δεν επηρεάζεται από την παρουσία των γλοιακών κυττάρων. Αυτό σημαίνει ότι όσον αφορά τη διαφοροποίηση, η τοπογραφία παίζει πιο σημαντικό ρόλο από τον συνεργατικό ρόλο των γλοιακών κυττάρων. Περαιτέρω μελέτη του φαινομένου μέσω μεθόδων ελέγχου πρωτεϊνών, θα συμβάλει στην κατανόηση της μεταγωγής μηχανικών σημάτων στα κύτταρα και στον τρόπο με τον οποίο τα κύτταρα μεταφράζουν τα μηχανικά σήματα του περιβάλλοντός τους σε βιοχημικά σήματα που ελέγχουν τη διαφοροποίηση.