Radiolabeled compounds in molecular imaging of pancreatic adenocarcinoma

Abstract

Pancreatic cancer (PC) was identified as the 10th most common cancer in humans and 4th cause of cancer deaths in USA in 2018. The asymptomatic character of PC at the early stages in combination with the lack of effective diagnostic tools for its early diagnosis contribute in these poor outcomes. Recent advances in nuclear medicine technology (positron emission tomography (PET) and single positron emission computed tomography (SPECT), alongside with the recent advent of novel molecular radiopharmaceuticals, may offer clinicians better diagnostic tools in near future. In this way, the visualization of primary and metastatic PC lesions may become feasible in a non-invasive, fast and convenient way, after interaction of the radiolabeled probe (e.g. a peptide radioligand) with cancer-related “finger-print” biomolecules – “targets” (e.g. a G – protein coupled receptor or GPCR). Currently, there is an urgent need for new radiolabeled probes for effective and reliable diagnosis of PC, and especially of exocrine pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) representing 95% of PC cases.Interestingly, neurotensin subtype 1 receptor (NTS1R) may serve as a viable biomolecular target in PDAC diagnosis, owing to its overexpression in 95% of PDAC cases in combination with its lack of expression in healthy pancreas and in chronic pancreatitis. The availability of the native NTS1R peptide ligand neurotensin (NT) and numerous synthetic NT-analogs provide the basis for the development of new NT-like radiopharmaceuticals. Like any peptide, NT and its analogs undergo rapid proteolytic degradation; two major peptidases, neprilysin (NEP) and angiotensin converting enzyme (ACE) are implicated in their rapid breakdown in the body. Likewise, NTS1R-targeting radiopeptides are degraded on their way to tumor sites with negative impact on their tumor-targeting capabilities.The aim of the present work was the development of new strategies and/or peptide radioligands based on the C-terminal hexapeptide NT(8-13), to improve in vivo stability, enhanced tumor-targeting and favorable overall pharmacokinetics and eventually suitable for accurate PC/PDAC diagnosis with SPECT. Two major approaches were pursued to achieve this goal: (1) Re-evaluation of previously reported [99mTc]Tc-labeled NT(8-13)-analogs without or during in situ inhibition of NEP and/or ACE. (2) Design of new NT-like radiopeptides after key-structural changes of the NT(8-13) motif; the diagnostic efficacy of these analogs was again evaluated without or during in situ NEP and/or ACE inhibition.To address the first task, previously reported NT analogs, DT1, DT5 and DT6 were labeled with Tc-99m. Their uptake in colon adenocarcinoma WiDr cells, stability in peripheral mice blood and biodistribution in WiDr tumor-bearing mice were compared, leading to the following conclusions: i) The Dab9/Arg9-substitution resulted in lower cell uptake in vitro, no measurable improvement of metabolic stability, lower uptake in WiDr tumors and elevated renal uptake. ii) the Tle12/Ile12-substitution drastically increased in vivo stability, but led to impaired cell uptake in vitro and tumor uptake in vivo. [99mTc]Tc-DT1 showed superior in vitro performance, combining excellent WiDr tumor targeting and fast pharmacokinetics in vivo during dual NEP and ACE inhibition. Hence [99mTc]Tc-DT1 was chosen as reference for the evaluation of the new structurally modified analogs.To test all analogs in a reliable and convenient NTS1R-positive PC model, the suitability of four different PC cell lines was compared: AsPC-1, PANC-1, MiaPaca-2 and Capan-1. By incubating [99mTc]Tc-DT1 with these cell lines the following rank of cell uptake was established: AsPC-1 >> PANC-1 >>MiaPaca-2 > CAPAN-1 cells. Furthermore, the tumorgenicity of AsPC-1 cells tested in SCID mice was found comparable with that of WiDr cells, with both cell lines requiring a time-span of 3 – 4 weeks for tumors to grow at the inoculation sites. In view of the above, AsPC-1 cells were selected as the PC cell line of choice in this thesis. Overall, the [99mTc]Tc-DT1 reference displayed similar performance both in vitro and in vivo between the WiDr and AsPC-1 cell models. Although phosphoramidon (PA) has been successfully applied for NEP inhibition thus far, a switch to the registered antihypertensive drug Entresto® was decided for such purposes, in support of future translation from animals to patients. Interestingly, Entresto® was proven equally effective as PA, with minor differences observed in the stabilization effects of the two agents attributed to: i) the administration routes (PA – iv, Entresto® - per os), ii) individual animal status and iii) the minor ACE-inhibition ability of PA at higher doses.In the second part of this thesis, structural modifications of the DT1 motif were adopted comprising two major interventions. C-terminal modification (1st group), or introduction of pendant groups in the original DT1 template. The first group comprises the analogs DT7 and DT13, both retaining high binding affinity for NTS1R. The respective [99mTc]Tc-radioligands showed increased in vivo stability in peripheral mice blood, although they achieved maximum stability only after treatment of mice with the Entresto®+Lisinopril (Lis) combination. Both [99mTc]Tc-DT7 and [99mTc]Tc-DT13 displayed poor uptake in AsPC-1 cells in vitro, thereby failing to qualifying for further study of their biodistribution profiles in AsPC-1 tumor-bearing mice.In the second lateral-modified set of compounds, a pendant lipid acid group was first attached: DT8. DT8 displayed an excellent affinity for NTS1R and [99mTc]Tc-DT8 high uptake in AsPC-1 cells. The radioligand stability in mice peripheral blood was excellent as well. These results translated into a very promising tumor uptake of [99mTc]Tc-DT8 in AsPC-1 xenografts bearing SCID mice, which however was compromised by a very unfavorable and persistently high background radioactivity. Thus, the strong binding of the lipid acid pendant group of [99mTc]Tc-DT8 to albumin and its high lipophilicity resulted in poor end-pharmacokinetics.In the 2nd generation of compounds with a lateral pendant group yielded DT9, DT10 and DT11. These modifications were excellently tolerated by the NTS1R, with DT9, DT10 and DT11 displaying sub-nanomolar receptor affinities. [99mTc]Tc-DT9 and [99mTc]Tc-DT10 were taken up by AsPC-1 cells equally well with [99mTc]Tc-DT1, while [99mTc]Tc-DT11 showed lower cell uptake. [99mTc]Tc-DT1 and [99mTc]Tc-DT11 demonstrated poor binding to albumin. In contrast, [99mTc]Tc-DT9 and [99mTc]Tc-DT10 were well bound to albumin, with their binding being significantly reduced by the albumin-binding pain-killer ibuprofen. While [99mTc]Tc-DT9 displayed similar in vivo stability with the [99mTc]Tc-DT1 reference in peripheral mice blood, [99mTc]Tc-DT10 and [99mTc]Tc-DT11 were significantly more stable, revealing the impact of steric factors. All radiotracers reached their maximum stability by treatment of animals with the Entresto®+Lis combination. It should be noted however that [99mTc]Tc-DT10 could achieve similar stability levels by Entresto® alone with [99mTc]Tc-DT9 and [99mTc]Tc-DT11 during Entresto®+Lis treatment. In SCID mice bearing AsPC-1 xenografts the three radioligands displayed by far a faster clearance from the background compared with [99mTc]Tc-DT8. In the control animals the uptake of the three new radioligands was higher than the [99mTc]Tc-DT1 reference, further increasing in the animals treated with the Entresto®+Lis combination ([99mTc]Tc-DT9 and [99mTc]Tc-DT11) or with Entresto® only ([99mTc]Tc-DT10). In conclusion, [99mTc]Tc-DT10, outperformed all analogs of the thesis in terms of stability, tumor targeting and background clearance, especially after treatment of animals with a single inhibitor, the registered drug Entresto®.These results emphasize the validity and importance of the in situ stabilization approach, leading to notable improvements in performance of biodegradable NTS1R-targeting radioligands. They have also shown that the introduction of pendant groups in modified NT(7-13) chains, was well tolerated by the NTS1R. The performance of resulting radioligands was found highly dependent on pendant group features, such as lipophilicity, albumin binding capability and steric factors. The performance of [99mTc]Tc-DT10 was very promising at the preclinical level, especially in combination with Entresto®, fairly competing with other NTS1R-targeting SPECT radiotracers already in clinical tests. Further studies are warranted to assess this option in PC patients.

Ο παγκρεατικός καρκίνος (PC) καταγράφηκε ως ο 10ος σε συχνότητα καρκίνος στον άνθρωπο και ως 4η αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ το 2018. Ο ασυμπτωματικός χαρακτήρας του PC σε συνδυασμό με την έλλειψη επαρκών διαγνωστικών μεθόδων για την έγκαιρη διάγνωση συμβάλλουν σε αυτήν την κατάσταση. Η πρόσφατη τεχνολογική πρόοδος στις απεικονιστικές διατάξεις της πυρηνικής ιατρικής (τομογραφία ποζιτρονίου (PET), ή υπολογιστική τομογραφία μονοφωτονιακής εκπομπής (SPECT)), παράλληλα με την πρόσφατη έλευση των νέων μοριακών ραδιοφαρμάκων, αναμένεται να προσφέρουν στους κλινικούς γιατρούς εξελιγμένα διαγνωστικά εργαλεία στο άμεσο μέλλον. Έτσι, αναμένεται να καταστεί δυνατή η απεικόνιση πρωτογενών και μεταστατικών εστιών PC μη παρεμβατικά, γρήγορα και με ευκολία, με την αλληλεπίδραση ραδιοσημασμένων μορίων (π.χ. ραδιοσημασμένων πεπτιδίων) με ειδικά βιομόρια – “στόχους” (π.χ. υποδοχείς πεπτιδίων), χαρακτηριστικών για τον καρκίνο. Σήμερα υπάρχει επείγουσα ανάγκη για νέα ραδιοφάρμακα για εφαρμογή στην ακριβή και αξιόπιστη διάγνωση του PC, και ιδιαίτερα του εξωκρινούς ποροειδούς αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος (PDAC) που αποτελεί το 95% των περιστατικών PC.Αξίζει να σημειωθεί ότι ο υποδοχέας 1 της νευροτενσίνης (ή νευροτανσίνης) (NTS1R) αντιπροσωπεύει υποψήφιο βιομοριακό στόχο στη διάγνωση του PDAC, δεδομένου ότι υπερεκφράζεται επιλεκτικά στο 95% των περιστατικών PDAC αλλά όχι στο υγιές πάγκρεας ή σε χρόνια παγκρεατίτιδα. Η ύπαρξη του ενδογενούς πεπτιδικού NTS1R-προσδέτη νευροτενσίνης (NT) και πληθώρας συνθετικών NT-αναλόγων δίνουν το έναυσμα για την ανάπτυξη NT-σχετικών ραδιοφαρμάκων. Όπως όλα τα πεπτίδια, η NT και τα ανάλογα της υφίστανται ταχεία πρωτεολυτική αποικοδόμηση. Δύο κυρίως πεπτιδάσες, η νεπριλυσίνη (NEP) και το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης (ή αγγειοτασίνης) (ACE) εμπλέκονται στην ταχεία αποικοδόμηση των αναλόγων NT στον οργανισμό. Παρόμοια, ραδιοπεπτίδια στόχευσης του NTS1R αποικοδομούνται κατά την πορεία τους στις καρκινικές εστίες με αρνητικά αποτελέσματα στην ικανότητα πρόσληψης τους εκεί.Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη νέων στρατηγικών ή/και πεπτιδικών ραδιοπροσδετών με βάση το C-τελικό εξαπεπτίδιο NT(8-13), ώστε να βελτιωθεί η in vivo σταθερότητα, η στόχευση των όγκων και η ολική φαρμακοκινητική, ώστε να αποβούν κατάλληλα και επιτυχή στην διάγνωση του PC/PDAC με SPECT. Για την επιτυχία αυτού του σκοπού εφαρμόστηκαν δύο μέθοδοι: (1) Επαναξιολόγηση γνωστών [99mTc]Tc-σημασμένων NT(8-13)-αναλόγων χωρίς ή με in situ αναστολή των NEP ή/και ACE. (2) Σχεδιασμός νέων NT-ραδιοπεπτιδίων με δομικές παρεμβάσεις-κλειδιά στο NT(8-13). Η διαγνωστική αξία των αναλόγων αυτών μελετήθηκε και πάλι χωρίς ή με in situ αναστολή των NEP ή/και ACE.Για την επίτευξη του πρώτου στόχου, τα ήδη γνωστά DT1, DT5 και DT6 επισημάνθηκαν με Tc-99m. Έγινε σύγκριση της πρόσληψης τους σε κύτταρα WiDr, της σταθερότητας τους στο αίμα υγιών ποντικιών και της βιοκατανομής τους σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια με όγκους WiDr, καταλήγοντας στα ακόλουθα συμπεράσματα: i) Η αντικατάσταση Dab9/Arg9 οδήγησε σε χαμηλότερη κυτταρική πρόσληψη in vitro, μη μετρήσιμη βελτίωση της μεταβολικής σταθερότητας, χαμηλότερη πρόσληψη σε όγκους WiDr και αυξημένη νεφρική εντόπιση. ii) Η αντικατάσταση Tle12/Ile12 αύξησε δραστικά την in vivo σταθερότητα, αλλά μείωσε την κυτταρική πρόσληψη in vitro και την πρόσληψη στον όγκο in vivo. Το [99mTc]Tc-DT1 εμφάνισε τις καλύτερες in vitro ιδιότητες, και συνδύασε άριστη στόχευση των όγκων WiDr με ταχεία φαρμακοκινητική in vivo με παράλληλη αναστολή των NEP και ACE. Ως εκ τούτου, [99mTc]Tc-DT1 επιλέχθηκε ως ένωση αναφοράς για την αξιολόγηση των νέων δομικά τροποποιημένων αναλόγων.Για την αξιολόγηση όλων των αναλόγων σε αξιόπιστο και πρακτικά εύχρηστο NTS1R-θετικό πρότυπο PC, έγινε σύγκριση της καταλληλότητας τεσσάρων διαφορετικών κυτταρικών σειρών PC: AsPC-1, PANC-1, MiaPaca-2 και Capan-1. Με επώαση του [99mTc]Tc-DT1 σε αυτά τα κύτταρα προέκυψε η ακόλουθη σειρά μειούμενης κυτταρικής πρόσληψης: κύτταρα AsPC-1 >> PANC-1 >>MiaPaca-2 > CAPAN-1. Επιπλέον, η ανάπτυξη όγκων μετά την εμφύτευση κυττάρων AsPC-1 σε ποντίκια SCID βρέθηκε παρόμοια με των κυττάρων WiDr, με τις δύο κυτταρικές σειρές να χρειάζονται χρονικό διάστημα 3 – 4 εβδομάδων για την ανάπτυξη όγκων στα σημεία της εμφύτευσης. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα AsPC-1 επιλέχθηκαν ως η κατάλληλη κυτταρική σειρά PC για την παρούσα διατριβή. Συνολικά, το [99mTc]Tc-DT1 έδειξε παρόμοια συμπεριφορά in vitro και in vivo πειραματικά πρότυπα των κυττάρων WiDr και AsPC-1. Παρότι η φωσφοραμιδόνη (PA) έχει μέχρι τώρα χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για αναστολή της NEP, αποφασίστηκε αλλαγή προς το εγκεκριμένο αντιϋπερτασικό φάρμακο Entresto® για τον σκοπό αυτό, προσβλέποντας σε μελλοντική «μετάφραση» της μεθοδολογίας από τα ποντίκια σε ασθενείς. Πράγματι, το Entresto® αποδείχθηκε εξίσου αποτελεσματικό με το PA, με τις όποιες παρατηρούμενες μικροδιαφορές στην σταθεροποιητική δράση των δύο αυτών αναστολέων να αποδίδονται: i) στον τρόπο χορήγησης (PA – iv, Entresto® - per os), ii) διαφορές μεταξύ των ζώων και iii) τη μικρή ικανότητα αναστολής του ACE από PA σε υψηλές δόσεις.Στη δεύτερη ενότητα της διατριβής, επιχειρήθηκαν δομικές παρεμβάσεις στο DT1 σύμφωνα με δύο βασικές στρατηγικές. Επιμήκυνση / αντικατάσταση στο C-τελικό άκρο, ή εισαγωγή πλευρικών ομάδων στην αρχική DT1 αλληλουχία. Η πρώτη ομάδα αναλόγων περιέλαβε τα DT7 και DT13, που διατήρησαν υψηλή συγγένεια δέσμευσης στον NTS1R. Οι αντίστοιχοι [99mTc]Tc-ραδιοπροσδέτες επέδειξαν αυξημένη in vivo σταθερότητα στην κυκλοφορία του αίματος σε υγιή ποντίκια, αλλά έφθασαν σε μέγιστη σταθερότητα μόνο μετά τη χορήγηση του συνδυασμού Entresto®+Lis στα ποντίκια. Τα [99mTc]Tc-DT7 και [99mTc]Tc-DT13 έδειξαν πολύ χαμηλή πρόσληψη σε κύτταρα AsPC-1 in vitro, οπότε δεν επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη της βιοκατανομής τους σε ποντίκια με όγκους AsPC-1.Στη δεύτερη ομάδα πλευρικά-τροποποιημένων αναλόγων, αρχικά προσδέθηκε ομάδα λιπαρού οξέος – DT8. Το DT8 έδειξε υψηλή συγγένεια δέσμευσης στον NTS1R και το [99mTc]Tc-DT8 υψηλή πρόσληψη σε κύτταρα AsPC-1 και υψηλή σταθερότητα στην κυκλοφορία του αίματος υγιών ποντικιών. Οι ιδιότητες αυτέςμεταφράστηκαν σε πολύ ικανοποιητική πρόσληψη του [99mTc]Tc-DT8 σε ετερομοσχεύματα AsPC-1 σε ποντίκια SCID, όμως συνδυάστηκε με ανεπιθύμητη και επίμονα υψηλή ακτινοβολία υποστρώματος. Συμπεραίνεται, ότι η ισχυρή δέσμευση της ομάδας λιπαρού οξέος του [99mTc]Tc-DT8 στην αλβουμίνη και η υψηλή της λιποφιλικότητα οδήγησαν σε μη επιθυμητή φαρμακοκινητική.Στη 2η γενιά αναλόγων 3 διαφορετικές πλευρικές ομάδες προσδέθηκαν στα: DT9, DT10 και DT11. Οι δομικές αυτές τροποποιήσεις δε μείωσαν την αλληλεπίδραση των αναλόγων με τον NTS1R, και τα DT9, DT10 και DT11 επέδειξαν υψηλή συγγένεια δέσμευσης στον υποδοχέα. Τα [99mTc]Tc-DT9 και [99mTc]Tc-DT10 προσλήφθηκαν σε κύτταρα AsPC-1 εξίσου ικανοποιητικά με το [99mTc]Tc-DT1, ενώ το [99mTc]Tc-DT11 έδειξε μειωμένη πρόσληψη. Οι ραδιοπροσδέτες [99mTc]Tc-DT1 και [99mTc]Tc-DT11 είχαν χαμηλή δέσμευση στην αλβουμίνη. Σε αντίθεση, τα [99mTc]Tc-DT9 και [99mTc]Tc-DT10 δεσμεύτηκαν σε ικανοποιητικό ποσοστό στην αλβουμίνη, με το ποσοστό αυτό να μειώνεται με προσθήκη του παυσίπονου ιμπουπροφένη (ibuprofen), που δεσμεύεται στην αλβουμίνη. Το [99mTc]Tc-DT9 έδειξε παρόμοια χαμηλή in vivo σταθερότητα με το [99mTc]Tc-DT1 στην κυκλοφορία του αίματος υγιών ποντικιών, με τα [99mTc]Tc-DT10 και [99mTc]Tc-DT11 να είναι σημαντικότερα πιο σταθερά, αναδεικνύοντας την επίδραση στερεοχημικών παραγόντων. Όλοι οι ραδιοπροσδέτες έφθασαν στο υψηλότερο ποσοστό σταθερότητας μετά τη χορήγηση του συνδυασμού Entresto®+Lis στα ποντίκια. Είναι αξιοσημείωτο το ότι το [99mTc]Tc-DT10 μετά τη χορήγηση του Entresto® μόνο επέτυχε παρόμοια ποσοστά σταθερότητας με αυτά των [99mTc]Tc-DT9 και [99mTc]Tc-DT11 μετά την συνδυαστική χορήγηση Entresto®+Lis. Σε ποντίκια SCID με ετερομοσχεύματα AsPC-1 οι τρεις ραδιοπροσδέτες επέδειξαν πολύ ταχύτερη κάθαρση υποστρώματος σε σύγκριση με το [99mTc]Tc-DT8. Η πρόσληψη των τριών ραδιοπροσδετών στους όγκους AsPC-1 στην ομάδα των μαρτύρων βρέθηκε σημαντικά αυξημένη σε σχέση με το [99mTc]Tc-DT1, και αυξήθηκε περαιτέρω με εφαρμογή του συνδυασμού Entresto®+Lis ([99mTc]Tc-DT9 και [99mTc]Tc-DT11) ή μόνο του Entresto® ([99mTc]Tc-DT10). Συμπερασματικά, το [99mTc]Tc-DT10, ξεπέρασε όλα τα ανάλογα της παρούσας διατριβής με κριτήρια τη σταθερότητα, τη στόχευση των όγκων και της ταχείας κάθαρσης υποστρώματος, ιδιαίτερα μετά την χορήγηση ενός μόνον αναστολέα στα ποντίκια, του εγκεκριμένου φαρμάκου Entresto®.Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν την αποτελεσματικότητα και σημασία της στρατηγικής της in situ σταθεροποίησης ραδιοπεπτιδίων, δεδομένου ότι οδήγησαν σε σημαντικές βελτιώσεις στη συμπεριφορά μεταβολικά ασταθών NTS1R-ραδιοπροσδετών. Επίσης ανέδειξαν ότι η προσθήκη πλευρικών ομάδων σε τροποποιημένες αλυσίδες NT(7-13), ήταν ανεκτή από τον NTS1R. Η συμπεριφορά των αντίστοιχων ραδιοπροσδετών δείχτηκε ότι εξαρτάται από τις ιδιότητες της πλευρικής ομάδας, όπως η λιποφιλικότητα, η ικανότητα δέσμευσης στην αλβουμίνη και στερεοχημικούς παράγοντες. Η συμπεριφορά του [99mTc]Tc-DT10 ήταν ιδιαίτερα ικανοποιητική σε προκλινικό επίπεδο, ιδιαίτερα σε συνδυασμό με Entresto®, ώστε να ανταγωνίζεται άλλους NTS1R-ραδιοπροσδέτες ήδη σε κλινική αξιολόγηση με SPECT. Ως εκ τούτου, περαιτέρω μελέτη απαιτείται για τη διερεύνηση της προοπτικής αυτής σε ασθενείς PC.