Ανάπτυξη πεπτιδικών ραδιοφαρμάκων με εφαρμογή στην ογκολογία

Abstract

Mapping of peptide receptors which overexpressed on the surface of various types of cancer cells has been in recent years the basis for in vivo molecular targeting of neoplastic diseases with radiolabeled peptides. Therefore, a significant number of peptide analogs have been designed to date in order to deliver appropriate diagnostic and therapeutic radionuclides selectively to cancer targets. In this way they offer individualized treatment of cancer for each patient in the context of "molecular diagnosis and treatment".The present thesis focuses on the development of peptide GRPR-antagonists radiolabeled with diagnostic and therapeutic radionuclides with improved biological characteristics, such as high metabolic stability and desirable biokinetics. It has initially included the comparison of biological behavior, with emphasis on pharmacokinetics in mice with human GRPR-positive xenografts, a GRPR-antagonist and an agonist with similar chemical structure. Afterwards, an attempt was made to increase the metabolic stability by targeted structural modification of the peptide sequence of a GRPR-antagonist, while the effect of different radiometals was evaluated on the stability and biological elements of the formed radiopeptides. Finally, subject of extensive study was the determination of the activity of the proteolytic enzyme NEP in a series of radiolabeled GRPR-antagonists, the definition of degradation sites, as well as the possibility of in-situ inhibition of its action in order to increase in vivo metabolic stability.In this context, two new GRPR-antagonists were designed and synthesized, SB4 and SB9, the well-known GRPR antagonist SB3, as well as its potential degradation products, metabolites M1-5. Their synthesis was carried out according to the solid phase synthesis strategy by Fmoc protection method and their identification was performed using RP-HPLC and MALDI-TOF MS.The results of in vitro & in vivo studies verified the superior pharmacokinetic and higher stability for the GRPR-antagonist [111In]SB9 versus the agonist [111In]AMBA, fact which is in consistent with the general perception that GRPR-antagonists are preferable relative to the respective agonists for the imaging and treatment of cancer tumors. Replacement of glycine-11 by D-alanine in the peptide sequence was confirmed as an effective way to increase metabolic stability, considering that [111In]SB4 appeared to be significantly more stable than [111In]SB3. However, this modification had a negative impact on the ability of SB4 to bind to GRPR and after all to the ability of targeting experimental PC-3 tumors for [111In]SB4. Finally, for all analogues, the possibility of further improvement of pharmacokinetics was demonstrated through in situ stabilization of radiopeptide analogues with the co-administration of the NEP inhibitor, PA. By the contribution of the original radiometabolites, which may be formed according to the literature and synthesized for this purpose, and by the application of radioanalytic chromatographic comparison methods, the degradation sites by NEP in the sequence of radiopeptides [111In/177Lu]SB3 were identified

Η χαρτογράφηση των πεπτιδικών υποδοχέων που υπερεκφράζονται στην επιφάνεια διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων έχει αποτελέσει τα τελευταία χρόνια τη βάση για την in vivo μοριακή στόχευση νεοπλασματικών ασθενειών με ραδιοεπισημασμένα πεπτίδια. Το διαρκώς αυξανόμενο ενδιαφέρον αναφορικά με τα ραδιοπεπτίδια αυτά έχει οδηγήσει στο σχεδιασμό αρκετών πεπτιδικών αναλόγων, τα οποία φέροντας το κατάλληλο ραδιονουκλείδιο είναι ικανά να προσφέρουν πολλές δυνατότητες στην εξατομικευμένη διάγνωση και θεραπεία ασθενών.Η παρούσα διατριβή εστιάζει στην ανάπτυξη ραδιοσημασμένων πεπτιδικών GRPR-ανταγωνιστών με διαγνωστικά και θεραπευτικά ραδιονουκλίδια, με βελτιωμένα βιολογικά χαρακτηριστικά, όπως κατάλληλη βιοκινητική και υψηλή μεταβολική σταθερότητα. Πραγματοποιήθηκε σύγκριση της βιολογικής συμπεριφοράς και της φαρμακοκινητικής ενός GRPR-ανταγωνιστή κι ενός αγωνιστή παρόμοιας χημικής δομής. Παράλληλα, έγινε προσπάθεια αύξησης της μεταβολικής σταθερότητας με στοχευμένη δομική τροποποίηση της πεπτιδικής αλληλουχίας ενός GRPR-ανταγωνιστή, ενώ αξιολογήθηκε και η επίδραση διαφορετικών ραδιομετάλλων στη σταθερότητα και τις βιολογικές του ιδιότητες των σχηματιζόμενων ραδιοπεπτιδίων. Αντικείμενο εκτενούς μελέτης αποτέλεσε και ο προσδιορισμός της δράσης του πρωτεολυτικού ενζύμου NEP, η ανάδειξη των σημείων που αποικοδομεί τα ραδιοπεπτιδικά ανάλογα, καθώς και η δυνατότητα αναστολής της δράσης της με στόχο την αύξηση της in vivo μεταβολικής σταθερότητας των ραδιοπεπτιδικών αναλόγων.Στο πλαίσιο αυτό σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν δύο νέοι GRPR-ανταγωνιστές, το SB4 και το SB9, ο γνωστός GRPR-ανταγωνιστής SB3, καθώς και τα πιθανά προϊόντα αποικοδόμησης του, μεταβολίτες M1-5. Η σύνθεση τους πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την στρατηγική σύνθεσης σε στερεά φάση με τη μέθοδο προστασίας Fmoc και η ταυτοποίηση τους πραγματοποιήθηκε με RP-HPLC και MALDI-TOF MS.Τα αποτελέσματα των in vitro & in vivo μελετών που πραγματοποιήθηκαν επαλήθευσαν την ανώτερη φαρμακοκινητική και υψηλότερη σταθερότητα για τον GRPR-ανταγωνιστή [111In]SB9 έναντι του αγωνιστή [111In]AMBA, γεγονός που συνάδει με τη γενικότερη αντίληψη ότι οι GRPR-ανταγωνιστές είναι προτιμότεροι από τους αντίστοιχους αγωνιστές για την απεικόνιση και τη θεραπεία καρκινικών όγκων. Επιβεβαιώθηκε ότι η αντικατάσταση της γλυκίνης από D-αλανίνη αποτελεί έναν αποτελεσματικό τρόπο αύξησης της μεταβολικής σταθερότητας, δεδομένου ότι το [111In]SB4 εμφανίστηκε σημαντικά πιο ανθεκτικό από το [111In]SB3 έναντι των πρωτεολυτικών ενζύμων, με αντίκτυπο τη σημαντική μείωση στην ικανότητα δέσμευσης στον GRPR και εν τέλει στην ικανότητα στόχευσης πειραμάτικων όγκων PC-3. Αποδείχθηκε η δυνατότητα για περαιτέρω βελτίωση της φαρμακοκινητική μέσω in situ σταθεροποίησης των ραδιοπεπτιδικών αναλόγων με τη συγχορήγηση PA ως αναστολέα της NEP. Τέλος, ταυτοποιήθηκαν οι θέσεις αποικοδόμησης λόγω της δράσης της NEP για το ραδιοπεπτίδια [111In/177Lu]SB3, μέσω της ταυτοποίησης των αντίστοιχων ραδιομεταβολιτών.