Ανάλυση της έκφρασης και του ρόλου των ρυθμιστικών RNAs σε ζωικά πρότυπα φλεγμονώδους πολυαρθρίτιδας

Abstract

RNAs, such as microRNAs (miRNAs) and lncRNAs constitute regulators of gene expression and are implicated in a variety of diseases spanning from inflammation to cancer. miRNA and lncRNA expression is deregulated in rheumatoid arthritis (RA), however, their specific role in key arthritogenic cells such as the synovial fibroblast (SF) remains elusive.We have shown in the past that the expression of the miR-221/222 cluster is upregulated in RA SFs. Here, we demonstrate that miR-221/222 activation is downstream of major inflammatory cytokines, such as TNF and IL-1β, which promote miR-221/222 expression independently. miR-221/222 expression in SFs from the huTNFtg mouse model of arthritis correlates positively with disease progression. Targeted transgenic overexpression of miR-221/222 in SFs of the huTNFtg mouse model led to further expansion of synovial fibroblasts and disease exacerbation. miR-221/222 overexpression altered the transcriptional profile of SFs resulting in over-represented pathways in cell cycle progression and under-represented pathways in ECM regulation. Validated targets of miR-221/222 included p27 and p57 cell cycle inhibitors (previously known targets of miR-221/222), as well as Smarca1 (a chromatin remodeling component), a newly defined target of miR-221/222. In contrast, complete genetic ablation of miR-221/222 in arthritic mice led to decreased proliferation of fibroblasts, reduced synovial expansion and attenuated disease. Finally, scATAC-seq data analysis revealed increased miR-221/222 gene activity in the pathogenic and activated clusters of the intermediate and lining compartment.Furthermore, we analyzed the expression of an underexplored class of regulatory RNAs in RA, such as the lncRNAs. To this end, analysis of differentially expressed lncRNAs in arthritic SFs from the huTNFtg mouse model was performed. Focus was given to lncRNA Gm11419, as it resides in a region next to the genetic locus of the CCL family of chemokines. Expression of Gm11419 was found to be upregulated, correlated with neighboring CCL expression and its genetic locus was conserved between mouse and human genome. Interestingly, several lncRNAs reside in the neighboring genetic locus of CCL genes in the human genome. These data led to the hypothesis that Gm11419 may regulate the expression of CCL genes. Gm11419 was induced under inflammatory signals, such as TNF, LPS and IL-1β and depended on TNF/TNFRI signaling. Finally, Gm11419 was detected in the chromatin fraction subcellularly, suggesting a possible function in regulating CCL expression.Taken together, our results establish an SF-specific pathogenic role of the miR-221/222 cluster in arthritis and suggest that its therapeutic targeting in specific subpopulations should inform the design of novel fibroblast-targeted therapies for human disease. Furthermore, the study of regulatory RNAs and their role in gene expression may illuminate disease mechanisms and lead to the discovery of new therapeutic schemes.

Τα ρυθμιστικά RNAs, όπως τα microRNAs (miRNAs) και τα lncRNAs αποτελούν ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης και εμπλέκονται σε μια ποικιλία ασθενειών, που περιλαμβάνουν τη φλεγμονή έως τον καρκίνο. Η έκφρασή τους είναι απορυθμισμένη στη Ρευματοειδή Αρθρίτιδα (ΡΑ), ωστόσο, ο ρόλος τους σε βασικά αρθριτογόνα κύτταρα όπως οι αρθρικοί ινοβλάστες (ΑΙ) παραμένει αδιευκρίνιστος.Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η έκφραση των miR-221/222 είναι αυξημένη σε ΑΙ από ασθενείς με ΡΑ καθώς και σε ΑΙ από το huTNFtg μοντέλο αρθρίτιδας. Με αυτήν την εργασία δείχνουμε ότι η ενεργοποίηση των miR-221/222 επάγεται από κύριες φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως ο TNF και η IL-1β. Μάλιστα, ο TNF και η IL-1β μπορούν να προάγουν την έκφραση των miR-221/222 ανεξάρτητα. Η έκφραση των miR-221/222 στους ΑΙ από το huTNFtg μοντέλο αρθρίτιδας συσχετίζεται θετικά με την εξέλιξη της νόσου. Η στοχευμένη διαγονιδιακή υπερέκφραση των miR-221/222 σε ΑΙ του huTNFtg μοντέλου οδήγησε σε περαιτέρω εξάπλωση των ΑΙ και σε επιδείνωση της νόσου. Η μεσεγχυματική υπερέκφραση των miR-221/222 άλλαξε το μεταγραφικό προφίλ των ΑΙ, ευνοώντας την ενεργοποίηση μονοπατιών, που εμπλέκονται στην προώθηση του κυτταρικού κύκλου και στην αναστολή μονοπατιών, που σχετίζονται με την παραγωγή της εξωκυττάριας ουσίας. Οι στόχοι των miR-221/222 περιλάμβαναν τους αναστολείς του κυτταρικού κύκλου p27 και p57 (γνωστοί στόχοι των miR-221/222), καθώς και ένα καινούριο στόχο το Smarca1 (συστατικό συμπλόκου αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης). Αντίθετα, η πλήρης απαλοιφή των miR-221/222 σε αρθριτικούς huTNFtg ποντικούς οδήγησε σε μειωμένο πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, μειωμένη εξάπλωση τους και αναστολή της εξέλιξης της νόσου. Τέλος, η ανάλυση των δεδομένων από την προσβασιμότητα της χρωματίνης στο επίπεδο του μοναδιαίου κυττάρου αποκάλυψε αυξημένη ενεργότητα του γενετικού τόπου των miR-221/222 στον παθογόνο υποπληθυσμό της έσω στοιβάδας και στον ενεργοποιημένο υποπληθυσμό της έξω στοιβάδας του αρθρικού υμένα.Επιπρόσθετα, σε αυτή τη μελέτη εξετάσαμε και το ρόλο καινούριων ρυθμιστικών RNAs στην αρθρίτιδα, των lncRNAs. Προχωρήσαμε, λοιπόν, στην ανάλυση των διαφορικά εκφρασμένων lncRNAs στους αρθριτικούς ΑΙ από το huTNFtg μοντέλο κι επικεντρωθήκαμε στο lncRNΑ Gm11419. Βρέθηκε να αποτελεί ένα πολλά υποσχόμενο lncRNΑ, καθώς εδράζεται στη γενετική περιοχή της οικογένειας των χημειοκινών CCLs. Βρέθηκε ότι η έκφραση του Gm11419 είναι αυξημένη, ακολουθεί την ίδια κατεύθυνση με αυτή των γειτονικών CCLs και η γενετική περιοχή είναι συντηρημένη και στο ανθρώπινο γονιδίωμα, με πολλά lncRNAs να βρίσκονται πριν τις CCLs. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν την υπόθεση ότι αυτό το lncRNA μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση των CCLs και περαιτέρω πειράματα θα μπορούσαν να αναδείξουν το ρόλο του στη νόσο. Το Gm11419 βρέθηκε κι αυτό να επάγεται έπειτα από την επίδραση φλεγμονώδων σημάτων, όπως TNF, LPS και IL-1β και μάλιστα η έκφρασή16του στο μονοπάτι σηματοδότησης μέσω του TNF εξαρτάται από τον υποδοχέα TNFRI. Τέλος, η τοπολογία των lncRNAs στο κύτταρο προτείνει και το μηχανισμό για τον τρόπο δράσης τους. Έτσι, το GM11419 ανιχνεύτηκε υποκυτταρικά στο κλάσμα της χρωματίνης κι αυτό αποτελεί άλλη μία σημαντική ένδειξη για τη ρύθμιση των γειτονικών CCL γονιδίων.Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας καθιερώνουν έναν ειδικό για τους ΑΙ παθογόνο ρόλο των miR-221/222 στην αρθρίτιδα και προτείνουν ότι η θεραπευτική τους στόχευση σε συγκεκριμένους υποπληθυσμούς θα μπορούσε να συμβάλλει στο σχεδιασμό νέων θεραπειών, που να στοχεύουν στους ινοβλάστες κατά τη ΡΑ. Επιπλέον, προτείνουμε ότι η μελέτη της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης μέσω διαφορετικών τύπων RNA μορίων έχει ιδιαίτερη σημασία στην εξέλιξη της αρθρίτιδας. Η ανάδειξη του ρόλου των μορίων RNA στη νόσο, μπορεί να αποτελέσει άλλο ένα εργαλείο για την ανακάλυψη νέων θεραπευτικών σχημάτων και να προωθήσει την επιστήμη τόσο στην εύρεση νέων τεχνολογικών μέσων στόχευσης όσο και στον κοινωνικό της ρόλο, που είναι άμεσα συνδεδεμένος με την ανακούφιση των ασθενών με ΡΑ.