Βιοχημικές μελέτες στην GSK3β-like κινάση LjSK1 από το Lotus japonicus

Abstract

The glycogen synthase kinases 3 family remains conserved throughout the eukaryotic evolution, from yeasts to plants and mammals. We studied the LjSK1 kinase of the Lotus japonicus plant, which is similar to the mammalian GSK3 and had previously been shown to be involved in nodule development. Purification of the enzyme was based on standard liquid protein chromatography methods and enzyme kinetics and mutagenesis studies were performed to compare LjSK1 with homologous mammalian kinases. Using a prime-phosphorylated peptide as substrate, LjSK1 showed optimal kinase activity at pH 8.0 and 20 ˚C, following Michaelis-Menten kinetics with kinetic parameters Km and Vmax, 8.2 μM and 111.6 nmol/min/mg respectively, for ATP.Site directed mutations were carried out and Lys167was proven to be a key amino acid of the enzyme catalytic triad, while at the same time it was clarified that the residues related to the specificity of the substrate in the human enzyme, do not have the same key role in the regulation of the specificity of LjSK1.Additional studies performed on the truncated LjSK190-467, indicated a different regulatory mechanism of LjSK1, by proteolysis of a domain located in the N-terminus, as the removal of 89 residues almost doubled its catalytic efficiency. At the same time, the effect of Lupeol, Betulinic acid and Hederacoside C triterpenes on the activity of LjSK1 was studied, revealing a strong inhibition.The 3D structure of LjSK190-467 was determined at 2.90 Å resolution, providing, for the first time, structural data for a plant GKS3 like kinase. Comparative structural analysis to the human GSK3β homologue, revealed significant differences at the N- and C-termini of LjSK190-467, supporting the notion for a different regulatory mechanism in plant GSK3-like kinases. Similarly, structural similarities of important functional domains, such as the catalytic center and the ATP binding site, explain the similarity in the function of these two proteins.We also evaluated the alteration of LjSK1 kinase activity in planta, by overexpressing mutant variants K167A and Y298A, as well as truncated LjSK190-467 in hairy roots of modified plants and a phenotype in nodulation and lateral root development was verified. Finally, by employing synthetic biology techniques, a new synthetic calcium-dependent protein kinase, CALM-LjSK190-467, which carries functional domains of both LjSK1, and human calmodulin, was produced. The aim of this new protein was to have a protective effect against plant infestation. Kinetic studies with CALM-LjSK190-467showed a significant increase of enzymatic activity in the presence of Ca2+.

Η οικογένεια των κινασών συνθάσης του γλυκογόνου 3, παραμένει συντηρημένη σε όλη την ευκαρυωτική εξέλιξη, από τις ζύμες στα φυτά και τα θηλαστικά. Μελετήσαμε την κινάση LjSK1 του φυτό Lotus japonicus που ομοιάζει με τις GSK3 των θηλαστικών και είχε προηγουμένως αποδειχτεί η συμμετοχή της στην ανάπτυξη φυματίων. Ο καθαρισμός και η απομόνωση του ενζύμου βασίστηκε σε κλασικές μεθόδους υγρής χρωματογραφίας πρωτεϊνών και με σκοπό να συγκριθεί η LjSK1 με τις ομόλογες κινάσες των θηλαστικών, πραγματοποιήθηκαν μελέτες ενζυμικής κινητικής και μεταλλαξιογέννεσης. Χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα ένα προ-φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο, η LjSK1 επέδειξε βέλτιστη δραστικότητα κινάσης σε τιμή pH 8.0 στους 20 ˚C, ακολουθώντας κινητική Michaelis-Menten και με κινητικές παραμέτρους Km και Vmax ως προς ATP, 8.2 μM και 111.6 nmol/min/mg αντίστοιχα. Επιλέχθηκαν να πραγματοποιηθούν στοχευμένες μεταλλάξεις στα αμινοξικά κατάλοιπα Ser9, Tyr298, Arg178, Lys287 και Lys167 τα οποία αντικαταστάθηκαν από Ala. Μέσω κινητικών μελετών, αποδείχθηκε ο συντηρημένος ρόλος του καταλοίπου Lys167 ως κύριο αμινοξύ της καταλυτικής τριάδας του ενζύμου, ενώ παράλληλα αποσαφηνίστηκε πως τα αντίστοιχα κατάλοιπα που σχετίζονται με την εξειδίκευση του υποστρώματος στο ανθρώπινο ένζυμο, δεν έχουν τον αντίστοιχο σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της εξειδίκευσης της LjSK1. Επιπρόσθετες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε φορέα που εκφράζει την περικεκομμένη LjSK190-467 υπέδειξαν ένα διαφορετικό μηχανισμό ρύθμισης της LjSK1, μέσω της πρωτεόλυσης τμήματος του Ν-τελικού άκρου της αρχικής πρωτεΐνης καθώς η απομάκρυνση 89 αμινοξέων αύξησε την καταλυτική ικανότητα σχεδόν δύο φορές. Ταυτόχρονα μελετήθηκε και η επίδραση των τριτερπενίων Lupeol, Betulinic acid και Hederacoside C στη δραστικότητα της LjSK1 αποκαλύπτοντας ισχυρή αναστολή.Επιλύθηκε η τρισδιάστατη δομή της LjSK190-467 σε ευκρίνεια 2.90 Å, παρέχοντας για πρώτη φορά πληροφορίες και δεδομένα που αφορούν μία κινάση που προέρχεται από τα φυτά και ομοιάζει με τις GSK3 των θηλαστικών. Οι σημαντικότερες διαφορές με την ανθρώπινη ομόλογη GSK3β παρατηρήθηκαν στο Ν- και C-λοβό της LjSK190-467, υποδεικνύοντας την πιθανότητα ύπαρξης ενός διαφορετικού μηχανισμού ρύθμισης των φυτικών GSK3. Παράλληλα, οι ομοιότητες στην αρχιτεκτονική σημαντικών λειτουργικών περιοχών, όπως το καταλυτικό κέντρο και η θέση πρόσδεσης της ATP εξηγούν τις κοινές λειτουργίες που εμφανίζουν οι δύο πρωτεΐνες. Επιπροσθέτως, αξιολογήθηκε ο βιολογικός ρόλος των μεταλλαγμένων μορφών της LjSK1, K167A και Y298A, καθώς και της περικεκομμένης LjSK190-467 στο ίδιο το φυτό και αποκαλύφθηκε ο φαινότυπος τους στην ανάπτυξη των φυματίων και των πλευρικών ριζών. Τέλος, μέσω τεχνικών συνθετικής βιολογίας παράχθηκε μία νέα συνθετική ασβεστοεξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση, η CALM-LjSK190-467, η οποία φέρει στοιχεία της LjSK1 και της ανθρώπινης καλμοδουλίνης. Σκοπός ήταν η νέα πρωτεΐνη να εμφανίζει προστατευτική δράση έναντι προσβολής φυτών από έντομα. ‘Έλεγχος μέσω κινητικών μελετών απέδειξε αύξηση της δραστικότητας της CALM-LjSK190-467 παρουσία Ca2+.