Σύνθεση νέων ετεροκυκλικών αναλόγων και αξιολόγηση της αντιφλεγμονώδους και αντικαρκινικής δράσης τους

Abstract

The aim of the present doctoral thesis is the design and synthesis of six Series of organic compounds consisting of (i) new heterocyclic analogues derived from the "privileged structure" of 4-hydroxy-2-quinolinone, as well as of (ii) Natural Products analogues, such as chalcones, aurones andphenolic acids. The bioactivity of the synthesized molecules was tested and useful trends regarding the impact of the different structural modifications on the bioactivity were determined.The structural identification was performed through Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H and 13C NMR), Infrared Spectroscopy (FT-IR), High Resolution Mass Spectrometry (HR-MS) and Mass Spectrometry with electrospray ionization (ESI-MS).Nine 3-acetyl-4-hydroxy-2-quinolinones (4a-4h and 7) were synthesized as precursors of the compounds of Series A (quinolinone-chalcones 9a-9g and quinolinone-pyrazolines 10a-10r). Eight N-substituted-3-methoxycarbonyl-4-hydroxy-2-quinolinones (12a-12h) were synthesizedas precursors of the heterocyclic molecules comprising Series B, C and E. Briefly, the synthetic route of all the heterocyclic quinolinone analogues is presented in Scheme 1.Synthetic routes (I & II): Seven quinolinone – chalcone hybrid molecules (9a-9g) were synthesized via Claisen-Schmidt aldol condensation reaction between 3-acetyl-4-hydroxy-2-quinolinones 4a and 7, and suitably substituted benzaldehydes (I). A chemical modification of the α, β-unsaturated carbonyl system was then applied to form eighteen new pyrazoline analogs (10a-10r) (II).Synthetic route (III): The synthesis of three quinolinone reverse amides (18a-18c) was achieved through the commercially available 4-hydroxy-2-quinolinone (16).Synthetic route (IV): A series of carboxamides (13a-13l, 14a-14i, 15a-15m and 23a-23g), possessing a variety of substituents at positions Y and R of their structure, was synthesized via aminolysis reaction between 3-methoxycarbonyl-4-hydroxy-2-quinolinone analogues (12a-12h) and various amines.Synthetic route (V): A series of new quinolinone – phenolic acid hybrids (22a-22g) was synthesized, which combine in their scaffold the N-ethyl-4-hydroxy-2-quinolinone structural feature, and selected benzoic acid (hybrid molecules 22a-22c) or cinnamic acid derivatives (hybrid molecules 22d-22g), connected with an amide linker.Synthetic route (VI): A series of new quinolinone – triazole hybrid molecules (25a-25k) was synthesized via the Huisgen 1,3-dipole cycloaddition reaction between alkynes and azides. In order to optimize the Huisgen reaction, and to enhance its environmentally friendly profile, some "green" approaches have been integrated into its implementation. Initially, the benefits of high-energy techniques were incorporated into the conduction of the reaction, and a comparison was made between conventional heating and microwave radiation.Furthermore, as a second "green" approach, a novel methodology was developed where an ascorbic acid based Ionic Liquid (IL) played the dual role of solvent and catalyst, replacing the organic solvent t-BuOH, the reducing agent sodium ascorbate and the base Et3N. The ILs used (IL-27a, IL-27b) were synthesized via a proton transfer reaction from an acid (ascorbic acid) to a base (ethanolamine or dimethyl-ethanolamine). The compounds of Series F were inspired by natural products, and include:Seventeen 2'-hydroxy-chalcone analogues (28a-28q), which were synthesized via aldol condensation and deprotection reactionsSix aurone analogues (29a-29f), which were synthesized via oxidative cyclization reactions of suitable chalcones, deprotection reactions, as well as via the use of an enzyme-catalyzed reaction: cyclization Fifteen esters, phenolic acids analogues (31a-31i, 32a-32f), synthesized via the Steglich esterification reaction.Three Trolox esters (34a-34c), synthesized via esterification reaction with suitable alkyl halidesAll the synthesized molecules were evaluated for their potential antioxidant activity through five in vitro techniques: (i) their ability to scavenge the stable free radical DPPH, (ii) their ability to inhibit lipid peroxidation of linoleic acid induced by AAPH free radical initiator, (iii) their ability to bind hydroxyl radicals, (iv) the reduction capacity of the cation radical (ABTS•+) and (v) their ability to bind superoxide anion. As an indication of their anti-inflammatory activity, the synthesized derivatives were evaluated as inhibitors of soybean lipoxygenase (LOX). In addition, selected derivatives were evaluated for cell viability in HaCaT epithelial cells and for their cytotoxicity in cancer lines A459 (adenocarcinoma cancer epithelial cells) and A375 (human melanoma cells) through the MTT method.The results of the study were very encouraging, highlighting several derivatives with satisfactory combined bioactivity, as shown in the following examples (Scheme 3): pyrazoline analogue 10b (83% inhibition of lipid peroxidation, 86% interaction with DPPH radical, IC50=10.0μM in LOX inhibition); carboxamide 14d (IC50=27.5μM in LOX inhibition, 100% inhibition of lipid peroxidation and 72.4% reducing ability of ABTS•+); carboxamide 15b (IC50=10.0μM in LOX inhibition, 100% interaction with DPPH radical and 93.0% inhibition of lipid peroxidation); quinolinone – triazole hybrid 25b (86.0% inhibition of lipid peroxidation; IC50=46.0μM in LOX inhibition; 49.9% cytotoxicity against adenocarcinoma epithelial cell carcinoma series - A549); chalcone 28p (95.7% interaction with DPPH radical, 68.0% hydroxyl radical scavenging ability and 86.0% reduction capacity of ABTS•+).Phenolic acid (31a-31i, 32a-32f) and Trolox analogues (34a-34c) were evaluated in terms of their photoprotective properties using an in vitro technique, where (i) the Sun Protection Factor (SPF) was determined as an indication of protection against UVB radiation, and (ii) the UVA/UVB absorption ratio and (ii) the critical wavelength λc, were determined as an indication of protection against UVA radiation. The results showed that esters 31e and 32f could act as potential UVB filters, exhibiting the most satisfactory SPF values (6.56 and 5.12, respectively), while the ferulic acid ester 32b was shown to be a potentially good UVA sunscreen, exhibiting the highest critical wavelength value (λc = 349.8nm), as well as a fairly high UVA/UVB ratio (0.405).Moreover, in the present thesis the inclusion complexes of quinolinone – pyrazoline hybrid molecules 10g and 10l in the natural oligosaccharide, β-cyclodextrin (β-CD), were synthesized and studied (Scheme 5).The determination the properties of the final inclusion complexes and the investigation of the way in which the “guest” molecule interacts with the "host" molecule were performed through the analytical techniques of DLS, FT-IR, NMR, DSC and TGA. In addition, the antioxidant activity of the pure compounds and of the formed complexes was evaluated through the in vitro determination technique of DPPH interaction. Overall, it turned out that β-CD is a good carrier for the pyrazoline analogs studied, as it enhanced their solubility in water, while maintaining their antioxidant activity.

Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε αρχικά η ανάπτυξη μικρών «χημικών βιβλιοθηκών», δηλαδή έξι Σειρών μορίων, αποτελούμενων από (i) νέα ετεροκυκλικά ανάλογα που προέρχονται από την «προνομιούχο δομή» της 4-υδροξυ-2-κινολινόνης, καθώς και από (ii) ανάλογα Φυσικών Προϊόντων, όπως είναι η χαλκόνη, η ωρόνη και τα φαινολικά οξέα. Τα μόρια που συντέθηκαν αξιολογήθηκαν ως προς τη βιολογική τους δράση και μελετήθηκε η επίδραση των διαφορετικών δομικών χαρακτηριστικών στη βιοδραστικότητα των μορίων.Ο δομικός χαρακτηρισμός πραγματοποιήθηκε μέσω Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (1H και 13C NMR), Φασματοσκοπίας Υπερύθρου (FT-IR), Φασματομετρίας Μάζας υψηλής ανάλυσης (HR-MS) και Φασματομετρίας Μαζών με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (ESI-MS).Αρχικά πραγματοποιήθηκε η σύνθεση εννέα 3-ακετυλο-4-υδροξυ-2-κινολινονών (4a-4h και 7), που αποτέλεσαν τις πρόδρομες ενώσεις για τη σύνθεση των μορίων της Σειράς Α (κινολινόνες-χαλκόνες 9a-9g και κινολινόνες-πυραζολίνες 10a-10r). Συντέθηκαν επίσης οκτώ Ν-υποκατεστημενες-3-μεθοξυκαρβονυλο-4-υδροξυ-2-κινολινόνες (12a-12h), οι οποίες αποτέλεσαν πρόδρομες ενώσεις για τη σύνθεση των ετεροκυκλικών μορίων που απαρτίζουν τις Σειρές Β, Γ και Ε. Συνοπτικά η συνθετική πορεία όλων των ετεροκυκλικών μορίων, παραγώγων κινολινόνης, παρουσιάζεται στο Σχήμα 1.Συνθετική πορεία (I & II): Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση επτά υβριδικών μορίων κινολινόνης – χαλκόνης (9a-9g) μέσω αντίδρασης αλδολικής συμπύκνωσης Claisen-Schmidt μεταξύ των 3-ακετυλο-4-υδροξυ-2-κινολινονών 4a και 7, και κατάλληλα υποκατεστημένων βενζαλδεϋδών (I). Έπειτα εφαρμόστηκε χημική τροποποίηση του α,β-ακόρεστου καρβονυλικού συστήματος, προς σχηματισμό δεκαοκτώ νέων ετεροκυκλικών πυραζολινικών αναλόγων (10a-10r) (II).Συνθετική πορεία (III): Mέσω της εμπορικά διαθέσιμης 4-υδροξυ-2-κινολινόνης 16 επιτεύχθηκε η σύνθεση τριών αντίστροφων αμιδίων κινολινόνης (18a-18c). Συνθετική πορεία (IV): Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μιας σειράς καρβοξαμιδίων (13a-13l, 14a-14i, 15a-15m και 23a-23g), τα οποία φέρουν μια ποικιλία διαφορετικών υποκαταστατών στις θέσεις Y και R της δομής τους, μέσω αντίδρασης αμινόλυσης μεταξύ των 3-μεθοξυκαρβονυλο-4-υδροξυ-2-κινολινονών (12a-12h) και διαφόρων αμινών. Συνθετική πορεία (V): Συντέθηκε μια σειρά νέων υβριδικών μορίων κινολινόνης – φαινολικών οξέων (22a-22g), τα οποία συνδυάζουν στο μόριο τους τη δομική μονάδα της Ν-αιθυλο-4-υδροξυ-2-κινολινόνης, με επιλεγμένα παράγωγα βενζοϊκού (υβριδικά μόρια 22a-22c) ή κινναμμωμικού οξέος (υβριδικά μόρια 22d-22g), που ενώνονται με τη βοήθεια ενός αμιδικού συνδέτη.Συνθετική πορεία (VI): Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μιας σειράς νέων υβριδικών μορίων κινολινόνης – τριαζολίου (25a-25k), μέσω της πιο διαδεδομένης αντίδρασης click χημείας, της Huisgen 1,3-διπολικής κυκλοπροσθήκης μεταξύ αλκινίων και αζιδίων, ανάμεσα στα καρβοξαμίδια 23a-23g, σε επιλεγμένα βρωμίδια και στο αζίδιο του νατρίου (NaN3). Με στόχο τη βελτιστοποίηση της αντίδρασης Huisgen, αλλά και την ενίσχυση του φιλικού προς το περιβάλλον χαρακτήρα της, ενσωματώθηκαν στην διεξαγωγή της ορισμένες «πράσινες» προσεγγίσεις. Αρχικά, στην διεξαγωγή της αντίδρασης εντάχθηκαν τα οφέλη των τεχνικών υψηλής ενέργειας, κι έτσι πραγματοποιήθηκε σύγκριση μεταξύ συμβατικής θέρμανσης και θέρμανσης μέσω μικροκυματικής ακτινοβολίας. Στη συνέχεια, ως δεύτερη «πράσινη» προσέγγιση, αναπτύχθηκε μια νέα μεθοδολογία όπου σε ρόλο διαλύτη και καταλύτη βρίσκεται ένα Ιοντικό Υγρό (ΙΥ) ασκορβικού οξέος (ΙΥ-27a, ΙΥ-27b), αντικαθιστώντας έτσι την παραδοσιακή χρήση του οργανικού διαλύτη t-BuOH, του αναγωγικού παράγοντα ασκορβικό νάτριο και της βάσης τριεθυλαμίνη (Et3N). Τα ΙΥ που χρησιμοποιήθηκαν, συντέθηκαν μέσω αντίδρασης μεταφοράς πρωτονίου από ένα οξύ (ασκορβικό οξύ) σε μία βάση (αιθανολαμίνη ή Ν,Ν-διμεθυλο-αιθανολαμίνη), κατά Bronsted.Η εμπνευσμένη από τα φυσικά προϊόντα σειρά μορίων (Σειρά ΣΤ) που αναπτύχθηκε στην παρούσα διατριβή, αποτελείται από:17 ανάλογα 2’-υδροξυ-χαλκόνης (28a-28q), τα οποία συντέθηκαν μέσω αντιδράσεων αλδολικής συμπύκνωσης και αποπροστασίας 6 ανάλογα ωρόνης (29a-29f), τα οποία σύντεθηκαν μέσω αντιδράσεων οξειδωτικής κυκλοποίησης κατάλληλων χαλκονών, αποπροστασίας, αλλά και μέσω ενζυμικά καταλυόμενης κυκλοποίησης.15 εστέρες, ανάλογα φαινολικών οξέων (31a-31i, 32a-32f), οι οποίοι συντέθηκαν μέσω αντίδρασης εστεροποίησης Steglich 3 εστέρες του υδατοδιαλυτού αναλόγου της Βιταμίνης Ε Τrolox (34a-34c), που συντέθηκαν μέσω αντίδρασης εστεροποίησης με κατάλληλα αλκυλαλογονίδιαΓια όλα τα μόρια που συντέθηκαν διερευνήθηκε η σχέση δομής – in vitro βιολογικής δράσης. Συγκεκριμένα, τα νέα παράγωγα αξιολογήθηκαν για την πιθανή αντιοξειδωτική τους δράση μέσω πέντε in vitro δοκιμών: (i) της ικανότητάς τους να δεσμεύουν τη σταθερή ελεύθερη ρίζα DPPH, (ii) της ικανότητάς τους να αναστέλουν τη λιπιδική υπεροξείδωση του λινελαϊκού οξέος που επάγεται από τον εκκινητή ελευθέρων ριζών AAPH, (iii) της ικανότητάς τους να δεσμεύουν τις ρίζες υδροξυλίου, (iv) της ικανότητας αναγωγής της ρίζας του κατιόντος ABTS ·+ και (v) της ικανότητας δέσμευσης του σουπεροξειδικού ανιόντος. Ως ένδειξη της αντιφλεγμονώδους δράσης τους, τα παράγωγα που συντέθηκαν αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου λιποξυγονάση από σόγια (LOX). Ακόμη, επιλεγμένα παράγωγα αξιολογήθηκαν ως προς την κυτταρική βιωσιμότητα σε επιθηλιακά κύτταρα HaCaT και ως προς την κυτταροτοξικότητά τους στις καρκινικές σειρές Α459 (καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα αδενοκαρκινώματος) και Α375 (κύτταρα ανθρώπινου μελανώματος), μέσω της μεθόδου ΜΤΤ.Τα αποτελέσματα της μελέτης ήταν πολύ ενθαρρυντικά, αναδεικνύοντας πολλά παράγωγα με αξιόλογη συνδυασμένη δράση, όπως ενδεικτικά φαίνεται στα ακόλουθα χαρακτηριστικά παραδείγματα (Σχήμα 3): πυραζολινικό ανάλογο 10b (86% αλληλεπίδραση με τη ρίζα DPPH, 83% αναστολή λιπιδικής υπεροξείδωσης, IC50=10.0μM στην αναστολή της LOX); καρβοξαμίδιο 14d (100% αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης, 72.4% ικανότητα αναγωγής της ρίζας του κατιόντος ABTS·+, IC50=27.5μΜ στην αναστολή της LOX); καρβοξαμίδιο 15b (100% αλληλεπίδραση με τη ρίζα DPPH, 93.0% αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης, IC50=10.0μΜ στην αναστολή της LOX); υβριδικό μόριο κινολινόνης – τριαζολίου 25b (86.0% αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης; IC50=46.0μΜ στην αναστολή της LOX; 49.9% κυτταροτοξικότητα έναντι της καρκινικής σειράς επιθηλιακών κυττάρων αδενοκαρκινώματος – Α549); χαλκόνη 28p (95.7% αλληλεπίδραση με τη ρίζα DPPH; 68.0% ικανότητα δέσμευσης των ριζών υδροξυλίου; 86.0% ικανότητα αναγωγής της ABTS•+).Επιπλέον, τα ανάλογα των φαινολικών οξέων (31a-31i, 32a-32f) και του Trolox (34a-34c) αξιολογήθηκαν ως προς την φωτοπροστατευτική τους ικανότητα μέσω in vitro τεχνικής, όπου προσδιορίστηκε (i) ο δείκτης ηλιακής προστασίας (SPF), ως ένδειξη προστασίας έναντι της UVB ακτινοβολίας, (ii) ο λόγος της απορρόφησης UVA/UVΒ και (iii) το κρίσιμο μήκος κύματος λc, ως ένδειξη προστασίας έναντι της UVA ακτινοβολίας. Από τα αποτελέσματα προέκυψε πως οι εστέρες 31e και 32f θα μπορούσαν να δράσουν ως πιθανά UVB φίλτρα, διαθέτοντας τις πιο ικανοποιητικές τιμές δείκτη SPF (6.56 και 5.12, αντίστοιχα), ενώ ο εστέρας του φερουλικού οξέος 32b χαρακτηρίστηκε ως αντηλιακό φίλτρο καλής UVA προστασίας, διαθέτοντας την υψηλότερη τιμή κρίσιμου μήκους κύματος (λc=349.8nm), καθώς και αρκετά υψηλό λόγο UVA/UVB (0.405).Επιπλέον, αντικείμενο της διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της σύνθεσης συμπλόκων εγκλεισμού των υβριδικών μορίων πυραζολίνης – κινολινόνης 10g και 10l στον φυσικό ολιγοσακχαρίτη β-κυκλοδεξτρίνη (β-CD), μέσω των τεχνικών της συγκαταβύθισης και της εξάτμισης διαλύτη.O προσδιορισμός των ιδιοτήτων του τελικού υλικού και η διερεύνηση του τρόπου με τον οποίο αλληλεπιδρούν το «φιλοξενούμενο» μόριο με το μόριο «ξενιστή», πραγματοποιήθηκαν μέσω των αναλυτικών τεχνικών DLS, FT-IR, NMR, DSC και TGA. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η αντιοξειδωτική δράση των καθαρών ενώσεων και των σχηματιζόμενων συμπλόκων, μέσω της in vitro τεχνικής προσδιορισμού της ικανότητας αλληλεπίδρασης με τη σταθερή ελέυθερη ρίζα DPPH.Συνολικά, προέκυψε πως η β-CD λειτούργησε ως καλός φορέας για τα πυραζολινικά ανάλογα που μελετήθηκαν, καθώς ενίσχυσε τη διαλυτότητά τους στο νερό, διατηρώντας την αντιοξειδωτική τους δράση.