Investigation of genetic and epigenetic factors in pediatric astrocytomas

Abstract

Histone modifications are a major epigenetic mechanism of gene regulation, contributing to the growth and development of tumors. The histone methylation marks profile in pediatric astrocytomas and the involvement of histone modifications in tumor growth is currently understudied. In the present study, we investigated the global expression patterns of repressive H3K9me3, H3K27me3, H4K20me3 and active H3K4me3, H3K36me3 histone marks along with their corresponding enzymes SUV39H1, SETDB1, EZH2, MLL2, SETD2 in pediatric astrocytomas of different grades of malignancy and archival normal brain tissues. Bioinformatics analysis of databases was performed first and then the findings were further confirmed by immunohistochemistry and Western blotting. Then, we proceeded to examine the functional role of methyltransferases in cell viability and migration by using methylation inhibitors as well as gene silencing of SETDB1 and SUV39H1 with specific siRNAs in two pediatric GBM patient-derived cell lines (CHLA-200, SJ-GBM2). Differential expression of selected genes associated with epithelial-mesenchymal transition and apoptosis was then evaluated. Overexpression of histone methyltransferase genes and deregulation of the histone code in pediatric astrocytomas were detected, with higher levels of H4K20me3, H3K4me3, SUV39H1, SETDB1 and SETD2 compared to normal brain tissues. Pilocytic astrocytomas (Grade I) exhibited lower levels of the enzyme MLL2 compared to diffusely infiltrating tumors, indicating a different pattern of epigenetic regulation between the two types of astrocytic neoplasms. Ηigher expression of H3K9me3, H3K36me3 and SETDB1 expression was detected in grade IIΙ/IV astrocytomas compared to grade II. In univariate survival analysis, high H3K9me3, MLL2 and low SUV39H1 expression was associated with reduced patients’ disease-specific survival. Upon multivariate survival analysis, only SUV39H1 expression was revealed as an independent prognostic factor of adverse significance. Inhibition of SUV39H1 reduced cell viability and migration of pediatric glioblastomas in vitro. The differential biological role of SUV39H1 and SETDB1 methyltransferases was further investigated in high-grade astrocytomas where a higher expression of SETDB1, a positive correlation of the expression of the two methyltransferases with proneural genes and a negative correlation with mesenchymal genes was found in bioinformatics analysis. Gene silencing of SETDB1 and SUV39H1 in pHGG cell lines showed a significant reduction in cell viability and migration. SETDB1 silencing reversed epithelial-mesenchymal transition (EMT) by decreasing the expression of the transcription factor SNAI1 and increasing the expression of E-cadherin. At the same time, it reduced the expression levels of N-cadherin and the MARCKS gene. Suppression of SUV39H1 failed to reverse EMT but significantly reduced the expression of the above EMT genes. In addition, the silencing of SETDB1 significantly increased the levels of the anti-apoptotic gene BCL-2 and the bivalent tumor suppressor gene SLC17A7. Collectively, our data implicate high levels of H3K9me3 histone modification in pediatric astrocytoma pathology, high expression of SUV39H1 being a positive prognostic factor for low grade astrocytomas, and high expression of SETDB1 being a negative prognostic factor. In addition, SETDB1 plays an oncogenic role as it is associated with the development of high-grade tumors and the reduced prognosis of patients, while SUV39H1 mainly affects cell adhesion and apoptosis.

Οι τροποποιήσεις ιστονών αποτελούν ένα κύριο επιγενετικό μηχανισμό γονιδιακής ρύθμισης, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη και την εξέλιξη νεοπλασιών. Το προφίλ μεθυλίωσης της ιστονών στα παιδιατρικά αστροκυτώματα και η συμμετοχή των ιστονικών τροποποιήσεων στην ανάπτυξη των όγκων δεν είχε μέχρι σήμερα μελετηθεί. Στην παρούσα διατριβή, διερευνήσαμε τα ολικά επίπεδα έκφρασης των σημαντικότερων κατασταλτικών H3K9me3, H3K27me3, H4K20me3 και ενεργοποιητικών H3K4me3, H3K36me3 ιστονικών τροποποιήσεων, μαζί με τα αντίστοιχα ένζυμα που τις καταλύουν, SUV39H1, SETDB1, EZH2, MLL2, SETD2 σε παιδιατρικά αστροκυτώματα διαφορετικού βαθμού κακοήθειας και σε φυσιολογικούς εγκεφαλικούς ιστούς. Αρχικά πραγματοποιήθηκε βιοπληροφορική ανάλυση βάσεων δεδομένων και στη συνέχεια επιβεβαίωση των ευρημάτων με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοαποτύπωση κατά Western. Επιπλέον, εξετάσαμε τον λειτουργικό ρόλο των μεθυλοτρανσφερασών στη βιωσιμότητα και μεταναστευτικότητα των νεοπλασματικών κυττάρων με αναστολείς μεθυλίωσης καθώς και γονιδιακή σίγαση των SETDB1 και SUV39H1 με siRNA σε δύο παιδιατρικές κυτταρικές σειρές γλοιβλαστώματος (CHLA-200, SJ-GBM2). Στη συνέχεια αξιολογήθηκε η διαφορική έκφραση επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση και την απόπτωση.Εντοπίσθηκε υπερέκφραση των γονιδίων των ιστονικών μεθυλοτρανσφερασών και απορρύθμιση του κώδικα των ιστονών στα παιδιατρικά αστροκυτώματα, με υψηλότερα επίπεδα των H4K20me3, H3K4me3, SUV39H1, SETDB1 και SETD2 σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς εγκεφαλικούς ιστούς. Τα πιλοκυτταρικά αστροκυτώματα (βαθμός κακοήθειας Ι) εμφάνισαν χαμηλότερα επίπεδα του ενζύμου MLL2 σε σύγκριση με τους διάχυτους όγκους, υποδεικνύοντας ένα διαφορετικό μοτίβο επιγενετικής ρύθμισης μεταξύ των δύο τύπων αστροκυτταρικών νεοπλασμάτων. Υψηλότερη έκφραση των H3K9me3, H3K36me3 και SETDB1 ανιχνεύθηκε στα αστροκυτώματα βαθμού κακοήθειας IIΙ / IV σε σύγκριση με τα αστροκυτώματα βαθμού II. Στη μονοπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης, η υψηλή έκφραση της τροποποίησης H3K9me3 και του ενζύμου MLL2 καθώς και η χαμηλή έκφραση της SUV39H1 συσχετίστηκε με μειωμένη επιβίωση των ασθενών. Κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης, μόνο η έκφραση της μεθυλοτρανσφεράσης SUV39H1 βρέθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας αρνητικής συσχέτισης. Οι αναστολείς μεθυλίωσης ιστονών, έδειξαν μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων και της κυτταρικής μεταναστευτικότητας μετά από αναστολή της SUV39H1 σε παιδιατρικές κυτταρικές σειρές.Ο διαφορικός βιολογικός ρόλος των μεθυλοτρανσφερασών SUV39H1 και SETDB1 διερευνήθηκε περαιτέρω στα υψηλόβαθμα αστροκυτώματα όπου παρατηρήθηκε υψηλότερη έκφραση της SETDB1, θετική συσχέτιση της έκφρασης των δυο μεθυλοτρανσφερασών με προνευρικά γονίδια και αρνητική συσχέτιση με μεσεγχυματικά γονίδια στη βιοπληροφορική ανάλυση. Η γονιδιακή σίγαση των SETDB1 και SUV39H1 στις κυτταρικές σειρές υψηλόβαθμων αστροκυτωμάτων έδειξε σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα και τη μετανάστευση των κυττάρων. Η σίγαση της SETDB1 ανέστρεψε την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMΜ) μειώνοντας την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα SNAI1 και αυξάνοντας την έκφραση της Ε-cadherin. Παράλληλα, μείωσε τα επίπεδα έκφρασης της Ν-cadherin και του γονιδίου MARCKS. Η καταστολή της SUV39H1 απέτυχε να αναστρέψει την EMΜ αλλά μείωσε σημαντικά την έκφραση των παραπάνω ΕΜΜ γονιδίων. Επιπλέον, η αποσιώπηση της SETDB1 αύξησε σημαντικά τα επίπεδα του αντι-αποπτωτικού γονιδίου BCL-2 και του δισθενούς ογκοκατασταλτικού γονιδίου SLC17A7. Συμπερασματικά, τα ευρήματα μας εμπλέκουν τα υψηλά επίπεδα της ιστονικής τροποποίησης H3K9me3 στην παθοβιολογία των παιδιατρικών αστροκυτωμάτων, την υψηλή έκφραση της SUV39H1 να αποτελεί θετικό προγνωστικό παράγοντα στα χαμηλόβαθμα, ενώ την υψηλή έκφραση της SETDB1 αρνητικό προγνωστικό παράγοντα στα υψηλόβαθμα αστροκυττώματα. Επιπλέον, η SETDB1 έχει ρόλο ογκογονιδίου καθώς σχετίζεται με την εξέλιξη των υψηλόβαθμων όγκων και την μειωμένη πρόγνωση των ασθενών, ενώ η SUV39H1 επηρεάζει κυρίως την κυτταρική προσκόλληση και την απόπτωση.