Μελέτη των γονιδίων της οικογένειας Groucho/TLE κατά την ανάπτυξη του τελεγκεφάλου του ποντικού

Abstract

The mammalian telencephalon develops into the most complex CNS structure and, perhaps into the most complex biological structure, the cerebral hemispheres. The cerebral hemispheres consist of the cortex, the underlying white matter, and the deep-subcortical nuclei, namely the basal ganglia, the amygdala and the hippocampal formation. Hemispheres contain a very large number of neuronal cell populations that differ in both morphological and functional characteristics and control perceptual, cognitive and superior motor functions. Although many of the neuronal populations that compose the cerebral hemispheres are, to a large extend defined in terms of their morphology and function, the mechanisms underlying the generation of these cell types remain still, poorly understood. Elegant studies in the past 20 years using a variety of approaches have established that transcription factors have key roles in the generation, specification and differentiation of these neuronal populations; analysis of the expression patterns of different transcription factors has revealed a code according to which the developing telencephalon is divided into anatomically and molecularly distinct territories, namely the pallium and the subpallium, which are further subdivided into smaller distinct domains. However little is known about the expression and the role of cofactors, especially corepressors in these developmental procedures. The members of the Groucho/Transducin-like Enhancer of split (Grg/TLE) family are nuclear proteins that lack intrinsic DNA-binding activity and interact with a variety of DNA-binding factors acting as transcriptional corepressors. Grg/TLE proteins are involved in several signaling pathways that regulate numerous developmental decisions in animals; they have been also implicated in various types of cancer and several other diseases. Groucho corepressor was the first identified and the only member of this family in Drosophila melanogaster. In mouse and human the Grg/TLE family consists of several members called Grgs (Groucho related genes) and TLEs (Transducin-like Enhancer ofsplit) respectively. Grg/TLE proteins are categorized in two subgroups the full-length Grg/TLEs and the truncated Grg/TLEs; the full-length Grg/TLEs just as the prototype of the family Groucho consist of five conserved domains, namely Q, GP, CcN, SP and WD40 while the truncated Grg/TLEs contain only some of these domains. In the mouse four genes, Grg1-4, encode full length Grgs while Grg5 and Grg6 encode truncated proteins. In addition truncated forms are produced by Grg1-4 genes via alternative-splicing. Grg/TLE proteins were traditionally regarded as constitutive factors with repressive activity regulated by the availability of their partners. Yet, in the past few years, it becomes increasingly evident, that during organogenesis, Grg/TLE gene expression is under tight spatial and temporal control generating local alterations in gene transcription. In this study a detailed comparative analysis of the spatiotemporal expression of the Grg1-4 full length family members during embryonic neurogenesis in the developing telencephalon is presented. In addition an in silico study to predict transcription factors likely to act upstream regulating Grg1-4 expression was performed. Preliminary analysis using in situ hybridization experiments on sagittal and coronal sections at E11.5-E18.5 showed that in the telencephalon Grg1- 4 are expressed with an overlapping but distinct pattern. Grg1 is expressed mainly in the ventricular zone of the telencephalon, Grg2 is mainly expressed in the ventral subpallium and its derivatives, Grg3 is broadly expressed in the proliferative zones of the telencephalon, and finally, Grg4 is expressed mainly in post mitotic cells of the subpallium. These results suggested that in several brain regions more than one members of the Grg family are expressed, thus we also performed comparative analysis using in situ hybridization on sagittal and coronal serial sections at E13.5; this is a stage that is crucial for the patterning and regionalization of the mammalian forebrain. We also used, along with Grg1-4, a number of well characterized markers, namely, Gsh2, Dlx2, Nkx2.1, Arx, Lhx6 and Lhx7/8. The analysis of the results revealed a complex pattern with distinct cell populations characterized by the combined expression of members of the Grg family. Notably, these results showed that in several structures, different combinations of Grgs are expressed, however, from the in situ hybridization experiments it was not possible to conclude if different cells within a structure express different Grgs or if Grgs are coexpressed in the same cell; this was especially the case of Grg2 and Grg4. To address this question double immunofluorescenceon primary cells dissociated from E13.5 mouse embryonic MGE with antibodies against Grg2 and Grg4 was performed; these experiments showed that at least in the MGE and based on the expression of Grg2 and Grg4 a Grg2+/Grg4+, a weak Grg2+, a strong Grg2+ and a Grg4+ subpopulation. Ιn conclusion, this approached showed that within a progenitor domain or telencephalic structure,distinct Grg combinations are expressed that may act differentially modify the action of transcription factors spatially restricted in this domain or structure forming a “Grg-mediated repressor map”. Thus, this Grg mediated map influences patterning or specification of this progenitor telencephalic domain or structure. Finally, an in silico study of potential regulatory sequences of Grgs (5' untranscribed sequences upto- 2000 bp from the transcription start and the first intron sequences of the rat and human genes) was conducted using the MatInspector and Transfac databases. The expression of the predicted potentialregulators during embryogenesis was analysed using Genepaint and Allen Brain databases leading tothe identification of 71 potential regulators of Grg.

Ο τελεγκέφαλος των θηλαστικών αναπτύσσεται στην πλέον πολύπλοκη δομή του ΚΝΣ, στα εγκεφαλικά ημισφαίρια. Τα τελευταία χρόνια, έχουν γίνει μεγάλες προσπάθειες για να χαρακτηριστούν, μέσω της ανάλυσης των προτύπων έκφρασης διαφορετικών μεταγραφικών παραγόντων, οι τελεγκεφαλικές περιοχές από τις οποίες προκύπτουν συγκεκριμένοι τύποι νευρώνων, αποκαλύπτοντας έναν τύπο μοριακού κώδικα σύμφωνα με τον οποίο ο αναπτυσσόμενος τελεγκέφαλος χωρίζεται σε ανατομικά και μοριακά διακριτές περιοχές, ήτοι το χιτώνιο και το υποχιτώνιο, που υποδιαιρούνται σε μικρότερες, μοριακά διακριτές περιοχές. Αν και ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχει επικεντρωθεί στους μεταγραφικούς παράγοντες που εμπλέκονται στο σχηματισμό νευρωνικών προγονικών κυττάρων και στη διαμόρφωση και τον χαρακτηρισμό των ανατομικών υποδιαιρέσεων του τελεγκεφάλου, λίγα είναι γνωστά για την έκφραση και το ρόλο των συμπαραγόντων και ιδιαίτερα των συγκατασταστολέων στις εν λόγω αναπτυξιακές διαδικασίες. Τα μέλη της οικογένειας συγκαταστολέων Groucho/Transducin-like Enhancer of split (Grg/TLE) είναι πυρηνικές πρωτεΐνες που στερούνται εγγενούς επικράτειας πρόσδεσης στο DNA, αλληλεπιδρούν με μία ποικιλία μεταγραφικών παραγόντων και εμπλέκονται σε πλήθος αναπτυξιακών διαδικασιών, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνου και ασθένειες. Οι Grg/TLE κατηγοριοποιούνται σε δύο υποομάδες με βάση τη δομή τους: στους πλήρους-μήκους Grg/TLE, που, όπως το πρωτότυπο μέλος της οικογένειας Groucho αποτελούνται από πέντε συντηρημένες επικράτειες και συγκεκριμένα τις Q, GP, CcN, SP και WD40 και στους ελλιπούς μήκους Grg/TLE. Στον ποντικό υπάρχουν τέσσερις Grg πλήρους μήκους (Grg1-4) και δύο ελλιπούς (Grg5 και 6). Επιπλέον, ορισμένες Grg ελλιπούς μήκους κωδικοποιούνται μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Οι πρωτεΐνες Grg/TLE θεωρούνταν παραδοσιακά ως καθολικά εκφραζόμενοι συμπαράγοντες των οποίων η κατασταλτική δραστηριότητα ρυθμίζονταν από τη διαθεσιμότητα των μεταγραφικών παραγόντων με τους οποίους αλληλεπιδρούν. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια, γίνεται όλο και πιο προφανές, ότι κατά τη διάρκεια της οργανογένεσης, η έκφραση των Grg/TLE βρίσκεται υπό αυστηρό χωρικό και χρονικό έλεγχο, δημιουργώντας τοπικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή πραγματοποιήθηκε μια λεπτομερής συγκριτική ανάλυση της χωροχρονικής έκφρασης των πλήρους μήκους μελών της οικογένειας Grg/TLE, δηλαδή των Grg1-4, κατά την εμβρυϊκή νευρογένεση στον αναπτυσσόμενο τελεγκέφαλο του ποντικού όπου ελάχιστα είναι γνωστά από προηγούμενες μελέτες. Επίσης, πραγματοποιήθηκε μελέτη in silico προκειμένου να προσδιοριστούν υποψήφιοι μεταγραφικοί παράγοντες που δρουν ανoδικά των προαναφερθέντων Grg.Πραγματοποιήθηκαν πειράματα υβριδοποίησης in situ σε οβελιαίες και στεφανιαίες τομές κατά τις Ε11,5 - Ε18,5. Το Grg1 εκφράζεται κυρίως στην κοιλιακή ζώνη του τελεγκεφάλου, το Grg2 κυρίως στο κοιλιακό υποχιτώνιο και τα παράγωγά του, το Grg3 εκφράζεται ευρέως στις βλαστικές ζώνες του τελεγκεφάλου, και το Grg4 εκφράζεται κυρίως σε μετα-μιτωτικά κύτταρα του υποχιτωνίου. Ακολούθησε συγκριτική ανάλυση σε διαδοχικές τομές και συγκριτική ανάλυση με τους καλά χαρακτηρισμένους δείκτες Gsh2, Dlx2, Nkx2.1, Arx, Lhx6 and Lhx7/8 η οποία αποκάλυψε ένα πολύπλοκο πρότυπο έκφρασης με διακριτούς κυτταρικούς πληθυσμούς που χαρακτηρίζονται από τη συνδυασμένη έκφραση των μελών της οικογένειας Grg. Συγκεκριμένα, πολλές δομές εκφράζουν διαφορετικούς συνδυασμούς των Grg, ωστόσο από τα πειράματα της υβριδοποίησης in situ δεν ήταν δυνατό να εξακριβωθεί σε μία προγονική επικράτεια ή δομή κατά πόσο διαφορετικά Grg εκφράζονταν σε διαφορετικά κύτταρα ή συνδυασμοί των Grg συνεκφράζονταν στο ίδιο κύτταρο, αυτό ήταν ιδιαίτερα εμφανές στην περίπτωση των Grg2 και Grg4. Προς διελεύκανση αυτού του ερωτήματος πραγματοποιήσαμε πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού σε κύτταρα πρωτογενούς καλλιέργειας MGE που απομονώθηκε από έμβρυο ποντικού ηλικίας E13,5 με αντισώματα που ήταν ειδικά έναντι των πρωτεϊνών Grg2 και Grg4. Τα εν λόγω πειράματα έδειξαν ότι τουλάχιστον στην MGE, με βάση την έκφραση των Grg2 και Grg4, είναι δυνατόν να χαρακτηριστούν οι υποπληθυσμοί Grg2+/Grg4+, ένας ασθενής υποπληθυσμός Grg2+, ένας ισχυρός υποπληθυσμός Grg2+ και ένας υποπληθυσμός Grg4+. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι σε αντίθεση με την επικρατούσα άποψη, τουλάχιστον κατά την ανάπτυξη του τελεγκεφάλου οι πρωτεΐνες Grg1-4 εκφράζονται με πολύπλοκο αλλά διακριτό πρότυπο έκφρασης τροποποιώντας διαφορικά τη δράση μεταγραφικών παραγόντων που περιορίζονται χωρικά σε αυτήν την περιοχή ή δομή, σχηματίζοντας τελικώς έναν «χάρτη μεταγραφικής καταστολής». Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση in silico των πιθανών ρυθμιστικών περιοχών (έως 2000 bp ανοδικά από το σημείο έναρξης της μεταγραφής και του πρώτου ιντρονίου, των γονιδίων Grg1-4) του ποντικού, στις βάσεις δεδομένων MatInspector και Transfac. Ακολούθησε αναζήτηση των συγκεκριμένων θέσεων αναγνώρισης στις αντίστοιχες περιοχές των ομολόγων των Grg1-4 του αρουραίου και του ανθρώπου, επειδή ενδεχόμενη συντήρησή τους μεταξύ των τριών ειδών θα αποτελούσε ισχυρή ένδειξη για κάποιο βιολογικό-ρυθμιστικό ρόλο. Η διαδικασία ολοκληρώθηκε με ανάλυση των δεδομένων έκφρασης των υποψήφιων ρυθμιστικών παραγόντων στις βάσεις δεδομένων χωρικής έκφρασης Genepaint και Allen Brain και τελικώς προσδιορίστηκαν 71 πιθανοί ρυθμιστές της έκφρασης των Grg.