Photoactive cyclodextrin derivatives for drug delivery

Abstract

In the search for photosensitizers with chemical handles to facilitate their integration into complex drug delivery nanosystems, new, unsymmetrically substituted, water insoluble meso-tetraphenylporphyrin (TPP) and meso-tetra(m-hydroxyphenyl)porphyrin (mTHPP) derivatives bearing one carboxyalkyl side chain of variable length were synthesized (TPPCOOHCx). It was found that permethyl-β-cyclodextrin (pMβCD) is their ideal monomerizing host and highly efficient shuttle to transfer them into water. New assembly modes of the extremely stable (Kbinding > 1012 M-2) 2:1 supramolecular complexes were identified. Moreover, is was shown that the complexes are photostable and do not disassemble in Fetal Bovine Serum (FBS)-containing cell culture media for 24 h. Incubation of breast cancer MCF-7 cells with the complexes resulted in intense intracellular fluorescence, strongly enhanced in the endoplasmic reticulum (ER). The complexes displayed high photokilling efficiency (~90%) and low dark toxicity. Overall, pMβCD stands out as a very capable molecular isolator of mono-carboxyalkyl-arylporphyrins that increases uptake and modulates their localization in the cells. The most efficient porphyrins are envisaged as suitable photosensitizers that can be linked to biocompatible drug carriers for photo- and chemo-therapy applications and this was pursued, next.Aiming the development of photoactive systems of higher complexity and functionality, the above carboxyalkyl-triphenylporphyrins (TPPCOOHCx) were connected to β-cyclodextrin (βCD) via alkyl chains of variable length (2, 5 and 11 C-atoms) to yield three new conjugates (TPPOCNHbmCx). The aspiration has been to capitalize on the strong amphiphilic character of the conjugates to construct drug-carrying photosensitizers that can be functionally integrated into advanced delivery nanosystems. It was found that all conjugates self-assemble similarly, to form mainly populations of ~60 nm nanoparticles (NPs), as shown by a range of methods. These NPs remain stable for at least 3 days in Phosphate Buffer Siline (PBS) solution. Moreover, the NPs also display similar photophysical properties, regardless of the length of the alkyl linkers, and upon irradiation they produce 1O2 at rates comparable or higher to a reference porphyrin mTHPP, while they exhibit sufficient photostability. Upon loading with selected anticancer drugs tamoxifen citrate (TamCit) and gemcitabine (GEM) the NPs grow in size up to ~150 nm due to un-twisting of the linker chains previously folded over the narrow βCD opening. Incubation of the NPs, alone or loaded with anticancer drugs, with human breast cancer cells MCF-7 resulted in confocal images with abundant, very intense spotted intracellular fluorescence, indicative of localization of the conjugates in membranes of endocytic vesicles and specifically lysosomes. Co-localization experiments and in-cell Förster Resonance Energy Transfer (FRET) with a lysotracker confirm the selective accumulation into these organelles. On the other hand, experiments with liposomes show that the NPs can be incorporated as monomers in artificial membranes with their βCD cavities available for guest inclusion. Photokilling experiments using MCF-7 cells incubated with drug-loaded NPs (TamCit and an N-adamantyl derivative of GEM) showed that the assemblies not only exert high toxicity (> 85 %) but also the cells cease to grow for at least 48 h, indicative of synergistic photo-triggered drug and 1O2 release and a manifestation of Photochemical Internalization (PCI). The most efficient conjugates (C2 and C5 chains) are therefore suitable to enable small molecule chemotherapeutics to be successfully integrated into PCI technology protocols.Supramolecular organization and self-assembly are the pillars of functionality of many nanosystems. The covalent conjugate (6-spirolactam rhodamine B-6-monodeoxy)-β-cyclodextrin (Rho-βCD) is assembled as a self-included, rigid nanostructure, identical in the crystalline state and in aqueous solution, as revealed by detailed X-ray and NMR analyses. Rho-βCD self-assembly is the result of an interesting reaction pathway, which partially de-aggregates Rho and disturbs the zwitterion ↔spirolactone equilibrium. Rho-βCD spirolactam not only is stable at pH 4.6, but also displays controllable photoswitching between the colored, fluorescent, zwitterionic open and the colorless, nonfluorescent closed structures, during several iterative cycles. After an initial drop in absorbance, the on-off process continues without further changes under our irradiation conditions, a consequence of the specific self-locked arrangement of Rho in the cavity. Rho-βCD exemplifies a water soluble photoresponsive nanosystem with improved photostability suggesting promising applications in super resolution bioimaging.

Στα πλαίσια αναζήτησης κατάλληλων φωτοευαισθητοποιητών με χημικές λαβές για τη διευκόλυνση της ενσωμάτωσής τους σε σύνθετα νανοσυστήματα χορήγησης φαρμάκου, συντέθηκαν νέα παράγωγα meso-τετραφαινυλοπορφυρίνης (TPP) και meso-τετρα(m-υδροξυφαινυλο)πορφυρίνης (mTHPP), μονο-υποκατεστημένα, αδιάλυτα στο νερό και φέρουν μία καρβοξυάλκυλο αλυσίδα (TPPOCOOHCx). Βρέθηκε ότι η περμεθυλ-β-κυκλοδεξτρίνη (pMβCD) ήταν ιδανικός ξενιστής μονομερισμού και εξαιρετικά αποτελεσματικός στη μεταφορά των φωτοευαισθητοποιητών στο νερό. Εντοπίστηκαν νέοι τρόποι οργάνωσης των εξαιρετικά σταθερών συμπλόκων εγκλεισμού (Kbinding > 1012 M-2) με στοιχειομετρία 2:1. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι τα σύμπλοκα είναι φωτοσταθερά και έπειτα από 24 ώρες δεν αποσυναρμολογούνται στο θρεπτικό υλικό κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS). Η επώαση των κυττάρων καρκίνου του μαστού MCF-7 με τα σύμπλοκα εγκλεισμού, έχει ως αποτέλεσμα έντονο ενδοκυτταρικό φθορισμό, ισχυρά ενισχυμένο στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER). Τα σύμπλοκα παρουσιάζουν υψηλή απόδοση φωτοτοξικότητας (~90%) και χαμηλή κυτταροτοξικότητα χωρίς ακτινοβολία. Συνολικά, η pMβCD ξεχωρίζει ως ένας πολύ ικανός μοριακός απομονωτής μονο-καρβοξυαλκυλο-αρυλοπορφυρινών που αυξάνει την πρόσληψη και ρυθμίζει τον εντοπισμό τους στα κύτταρα. Οι πιο αποτελεσματικές πορφυρίνες μπορούν να θεωρηθούν ως κατάλληλοι φωτοευαισθητοποιητές που μπορούν να συνδεθούν με βιοσυμβατούς φορείς φαρμάκων για εφαρμογές φωτο- και χημειοθεραπείας και αυτό επιδιώχθηκε στη συνέχεια.Με στόχο την ανάπτυξη φωτοδραστικών συστημάτων υψηλότερης πολυπλοκότητας και λειτουργικοτητας, οι παραπάνω καρβοξυαλκυλο-πορφυρίνες (TPPΟCOOHCx) συνδέθηκαν με β-κυκλοδεξτρίνη (βCD) μέσω αλειφατικών γεφυρών μεταβλητού μήκους (2, 5 και 11 άτομα C) αποδίδοντας τρία νέα συζεύγματα (TPPOCNHbCx). Ο στόχος ήταν να αξιοποιηθεί ο ισχυρά αμφίφιλος χαρακτήρας των συζευγμάτων για την κατασκευή φωτοευαισθητοποιητών-φορέων φαρμάκου, που μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε λειτουργικά προηγμένα νανοσυστήματα μεταφοράς. Βρέθηκε ότι όλα τα συζεύγματα αυτοοργανώνονται με παρόμοιο τρόπο, για να σχηματίσουν κυρίως πληθυσμούς νανοσωματιδίων(NPs) μεγέθους ~60 nm, όπως δείχθηκε με μια σειρά μεθόδων. Τα NPs παραμένουν σταθερά για τουλάχιστον 3 ημέρες σε διάλυμα PBS. Επιπλέον, τα NPs παρουσιάζουν παρόμοιες φωτοφυσικές ιδιότητες, ανεξάρτητα από το μήκος της αλειφατικής γέφυρας και κατά την ακτινοβόληση παράγουν 1O2 σε ρυθμούς συγκρίσιμους ή υψηλότερους μιας πορφυρίνης αναφοράς, ενώ εμφανίζουν επαρκή φωτοσταθερότητα. Κατά τον εγκλωβισμό επιλεγμένων αντικαρκινικών φαρμάκων, δηλαδή της κιτρικής ταμοξιφαίνης (TamCit) και γεμσιταβίνης (GEM), τα NP αυξάνονται έως και ~150 nm, λόγω της απομάκρυνσης των αλειφατικών γεφυρών που είχαν προηγουμένως αναδιπλωθεί πάνω από το στενό άνοιγμα της βCD. Η επώαση των NPs, είτε ως έχουν είτε αφού είχε προηγηθεί η αυτο-οργάνωσή τους παρουσία αντικαρκινικών με ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μαστού MCF-7, οδήγησε σε εικόνες συνεστιακού μικροσκοπίου με άφθονο, πολύ έντονο στικτό ενδοκυτταρικό φθορισμό, ο οποίος είναι ένδειξη εντοπισμού των συζευγμάτων σε μεμβράνες ενδοκυτταρικών κυστιδίων και συγκεκριμένα λυσοσωμάτων. Πειράματα συνεντοπισμού και ενδοκυτταρικής μεταφοράς ενέργειας συντονισμού κατά Förster (FRET) με λυσοσωμικό ιχνηλάτη επιβεβαιώνουν την επιλεκτική συσσώρευσή των NPs σε αυτά τα οργανίδια. Από την άλλη πλευρά, πειράματα με λιποσώματα δείχνουν ότι τα NPs μπορούν να ενσωματωθούν ως μονομερή σε τεχνητές μεμβράνες με τις κοιλότητες των βCD διαθέσιμες για εγκλεισμό ξενιζόμενων μορίων. Πειράματα φωτοτοξικότητας χρησιμοποιώντας κύτταρα MCF-7 που έχουν επωαστεί με NP με φαρμακευτικό φορτίο (TamCit και ένα παράγωγο Ν-αδαμάντυλο GEM) όχι μόνο εμφανίζουν υψηλή τοξικότητα (> 85 %) αλλά και τα κύτταρα παύουν να αναπτύσσονται για τουλάχιστον 48 ώρες, ενδεικτικό συνεργιστικής απελευθέρωση φαρμάκου και 1Ο2 με τη δράση φωτός και μια εκδήλωση φωτοχημικής ενσωμάτωσης (PCI). Τα πιο αποτελεσματικά συζεύγματα (γέφυρες C2 και C5) είναι επομένως κατάλληλα για να επιτρέψουν την επιτυχή ενσωμάτωση μικρών χημειοθεραπευτικών μορίων σε πρωτόκολλα τεχνολογίας PCI.Η υπερμοριακή οργάνωση και η αυτο-οργάνωση είναι οι πυλώνες της λειτουργικότητας πολλών νανοσυστημάτων. Το ομοιοπολικό σύζευγμα (6-σπειρολακταμική ροδαμίνη Β-6-μονοδεοξυ)-β-κυκλοδεξτρίνη (Rho-βCD) συγκροτείται ως αυτοσυμπεριλαμβανόμενη, άκαμπτη νανοδομή, πανομοιότυπη στον κρύσταλλο και σε υδατικό διάλυμα, όπως αποκαλύπτεται από λεπτομερείς αναλύσεις με κρυσταλλογραφία ακτίνων X και φασματοσκοπία NMR. Το αυτο-οργανωμένο παράγωγο Rho-βCD είναι το αποτέλεσμα ενός ενδιαφέροντος μονοπατιού αντίδρασης, η οποία αποσυσσωματώνει εν μέρει τη Rho και διαταράσσει την ισορροπία αμφιτεριόντος↔σπειρολακτόνης. Το Rho-βCD όχι μόνο είναι σταθερό σε pH 4.6, αλλά επίσης εμφανίζει ελεγχόμενη φωτοεναλλαγή μεταξύ της έγχρωμης, φθορίζουσας, αμφιτεριονικής και άχρωμης, μη φθορίζουσας κλειστής δομής, κατά τη διάρκεια αρκετών επαναληπτικών κύκλων. Μετά από μια αρχική πτώση της απορρόφησης, η διαδικασία on-off συνεχίζεται χωρίς περαιτέρω αλλαγές υπό τις συνθήκες ακτινοβόλησης, συνέπεια της συγκεκριμένης αυτό-κλειδωμένης διάταξης της Rho στην κοιλότητα. Το Rho-βCD αποτελεί παράδειγμα ενός υδατοδιαλυτού φωτοευαίσθητου νανοσυστήματος με βελτιωμένη φωτοσταθερότητα, υποδηλώνοντας πολλά υποσχόμενες εφαρμογές στη βιοαπεικόνιση υψηλής ανάλυσης.