Γενωμική διερεύνηση μη ταυτοποιημένων μυοπαθειών

Abstract

Introduction: Myopathies represent a heterogeneous group of neuromuscular disorders primarily affecting the skeletal muscle tissue. Hereditary myopathies are the most common, and present with more severe clinical features. Over 200 genes, including some of the largest ones in humans, have been implicated in myopathies. Prompt diagnosis may be challenging due to clinical heterogeneity and clinical overlaps, in addition to the large number and diversity of candidate genes and underlying mechanisms. Aim of the study: 1.The use of an NGS-based diagnostic approach to allow identification of causative variants, in muscle specific genes, for patients with a clinical presentation suggestive of myopathy. 2.Further analysis of muscle mRNA and gene expression in the presence of variants like splicing alterations. Material and methods: Eighty-six patients (38 female and 48 male) were referred for genetic evaluation because of variable clinical presentations ranging from asymptomatic hyper-CK-hemia to progressive proximal muscle weakness. Genetic analysis was performed with Whole Exome Sequencing (WES) or semi-targeted Exome Sequencing comprising ~4900 genes linked to known genetic disorders. Bioinformatic data analysis used SOPHiA DDM (Sophia Genetics) and VarAFT 2.14. software. Variants were classified according to the 2015 American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) criteria.In addition, six patients with a clinical diagnosis of muscular dystrophy and a positive muscle biopsy underwent RNA analysis with total mRNA extraction, reverse transcription and cDNA sequencing. Results: Causative variants were detected in 55 out of the 86 cases indicating a high diagnostic yield (63,95%). In total, 71 pathogenic/likely pathogenic variants were found in 25 genes linked to myopathies. Twenty two (31 %) were characterized as novel and four pathogenic copy number variations (CNV) were also detected. Most variants were missense (n=46, 65%), 8 were nonsense (11%), 8 frameshifts (11%) and only 2 variants were in frame (3%). In addition, 3 splice site pathogenic variants in 3 unrelated patients (4%) were disclosed. RNA analysis in 5/6 patients revealed alterations of splicing pathways whereby leading to more than one alternative transcripts. Discussion: In line with international efforts towards developing diagnostic algorithms for myopathies this study applied protocols to facilitate the diagnosis of complex and heterogeneous disorders, like the hereditary myopathies, in a large scale of Greek patients for the first time. Our results are considered to contribute significantly to the recognition of these disorders as well as provide evidence for genotype-phenotype correlation.

Εισαγωγή: Οι μυοπάθειες αποτελούν μια ετερογενή ομάδα επίκτητων ή γενετικών νευρομυϊκών νοσημάτων, στα οποία η πρωτοπαθής διαταραχή εντοπίζεται στο σκελετικό μυ. Οι μυοπάθειες γενετικής αιτιολογίας αποτελούν τις πιο συχνές και εκδηλώνονται με βαρύτερη κλινική εικόνα. Μέχρι σήμερα, περισσότερα από 200 γονίδια, συμπεριλαμβανομένων και ορισμένων από τα μεγαλύτερα γονίδια που συναντώνται στον ανθρώπινο οργανισμό, έχουν συνδεθεί με μυοπάθειες. Η γενετική διάγνωση των μυοπαθειών αφορά την ανίχνευση παθογόνων ή πιθανώς παθογόνων παραλλαγών σε ένα (ή περισσότερα) γονίδια και συνιστά μια τεράστια πρόκληση. Η μεγάλη κλινική ετερογένεια, ακόμα και ανάμεσα σε ασθενείς στην ίδια οικογένεια, η αλληλοεπικάλυψη κλινικών εκδηλώσεων καθώς και ο μεγάλος αριθμός διαφορετικών υποψήφιων γονιδίων που εμπλέκονται στη παθογένεια των μυοπαθειών δυσχεραίνουν τη διαφορική διάγνωση και καθιστούν την αποκάλυψη της γενετικής βλάβης και την κατανόηση του αντίστοιχου υποκείμενου μηχανισμού απαραίτητα για την τελική διάγνωση. Σκοπός της μελέτης: 1. Η εύρεση αιτιοπαθογόνων παραλλαγών σε «μυοειδικά» γονίδια μέσω της μεθοδολογίας τη αλληλούχησης επόμενης γενιάς (Next generation sequencing, ΝGS) σε ασθενείς με κλινική διάγνωση συμβατή με μυοπάθεια και με αρνητικό εύρημα μετά από στοχευμένους ελέγχους. 2. Η μελέτη της επίδρασης παραλλαγών, όπως οι παραλλαγές ματίσματος, στο επίπεδο της μεταγραφής και του mRNA. Υλικά και μέθοδοι: Μελετήθηκαν δείγματα από 86 ασθενείς (38 θήλεα και 48 άρρενα) που παραπέμφθηκαν για γενετική διερεύνηση μυοπαθειών λόγω ευρέος φάσματος κλινικών εκδηλώσεων που περιλαμβάνουν από ασυμπτωματική υπερ-CK-αιμία μέχρι προοδευτικά εξελισσόμενη κεντρομελική μυϊκή αδυναμία. Οι ασθενείς κατηγοριοποιήθηκαν περαιτέρω σε υπoτύπους μυοπαθειών με βάση την κλινική εικόνα. Η μοριακή ανάλυση περιελάμβανε την εφαρμογή αλληλούχησης επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing) και συγκεκριμένα Whole Exome Sequencing-WES (ανάλυση των κωδικοποιουσών περιοχών ~19,000 γονιδίων) ή Clinical Exome Panel Sequencing-CES (ανάλυση των κωδικοποιουσών περιοχών ~4.500 γονιδίων που έχουν συσχετισθεί με νόσους). Η βιοπληροφορική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τα συστήματα SOPHIA DDM και VarAFT και οι παραλλαγές αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια του Αμερικανικού κολλεγίου Ιατρικής Γενετικής, ACMG.Επιπρόσθετα, σε 6 ασθενείς με κλινική εικόνα μυϊκής δυστροφίας και θετική βιοψία μυός πραγματοποιήθηκε περαιτέρω έλεγχος σε μεταγραφικό επίπεδο με την απομόνωση ολικού RNA από μυϊκό ιστό και ακολούθως πραγματοποίηση αντίστροφης μεταγραφής και ανάλυσης της αλληλουχίας των μεταγράφων. Αποτελέσματα: Ανιχνεύθηκαν παθογόνες ή πιθανώς παραλλαγές σε 55 ασθενείς αναδεικνύοντας ποσοστό συνολικής διαγνωστικής απόδοσης 63,95%, για την αλληλούχηση επόμενης γενιάς στην παρούσα μελέτη. Πιο συγκεκριμένα, η μοριακή ανάλυση αποκάλυψε 71 διακριτές παθογόνες ή πιθανώς παθογόνες παραλλαγές σε 25 γονίδια που σχετίζονται με μυοπάθειες. Η πλειοψηφία των παραλλαγών ήταν παρερμηνεύσιμες (n=46, 65%), 8 (11%) ήταν ανερμηνεύσιμες, 3 (4%) παραλλαγές ματίσματος, 8 (11%) αφορούσαν παραλλαγές μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης των γονιδίων, ενώ μόλις 2 (3%) είχαν σαν αποτέλεσμα τη διατήρηση του. Ανιχνεύθηκαν, επίσης, 4 παραλλαγές αριθμού αντιγράφων (Copy Number Variants, CNVs) οι οποίες μαζί με άλλες 22/71 (31%) παραλλαγές χαρακτηρίστηκαν ως νέες.H ανάλυση σε επίπεδο RNA αποκάλυψε αλλαγή στη μεταγραφή των γονιδίων σε 5/6 ασθενείς με τη δημιουργία εναλλακτικών μεταγράφων και προϊόντων cDNA διαφορετικού μεγέθους συγκριτικά με το φυσιολογικό μετάγραφο, ερμηνεύοντας την κλινική εικόνα των ασθενών. Συμπεράσματα: Συμβαδίζοντας με τα διεθνή πρότυπα αναζήτησης διαγνωστικών αλγορίθμων για την μελέτη των γενετικών μυοπαθειών η παρούσα μελέτη παρουσιάζει την εφαρμογή και αξιολόγηση εργαστηριακών πρωτοκόλλων για τη διαγνωστική και ερευνητική προσέγγιση των μυοπαθειών. Η έρευνα αφορά την πρώτη και μεγαλύτερη σε αριθμό ασθενών και εύρος γονιδίων, μελέτη των γενετικών μυοπαθειών στον Ελλαδικό χώρο και αναμένεται να συμβάλει σημαντικά τόσο στην αναγνώριση των νοσημάτων αυτών, όσο και στην καταγραφή τους με βάση την υποκείμενη μοριακή διαταραχή της σύμφωνα με την οποία επιτρέπεται αναλυτική συσχέτιση γονοτύπου-φαινοτύπου.