Μελέτη της έκφρασης ισόμορφων φωσφολιπάσης Α2 σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου

Abstract

Background/Aim: Phospholipases A2 (PLA2) are enzymes that regulate metabolism of the phospholipids by hydrolyzing them into fatty acids. Peroxiredoxin-6 (PRDX-6) is a protein acting as antioxidant enzyme and partially as PLA2 phospholipase involved in a variety of metabolic functions including mainly the intracellular hydrogen peroxide (H2O2) levels reduction and the repair of altered cellular membranes. They play a critical role in cellular signaling, inflammation, atherosclerosis and in cancer. The aim of this study is to investigate the expression of PLA2G2A, PLA2G3, PRDX6 in colon adenocarcinomas (CRC).Methods: Gene /protein tissue expression was studied at tissue and plasma levels by total protein assay Lowry method, protein electrophoresis in denatured polyacrylamide gel (SDS-PAGE), immunoblotting of proteins, total RNA content assay isolation and purity control, mRNA reverse transcription cDNA synthesis and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) in 14 CRC patients with a mean age 73.5 (53-91). In addition, a series of thirty (n = 30) formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections of primary CRCs of patients with a mean age of 77 (53-90) were studied. Immunohistochemistry and digital image analysis (Digital Image Analysis) were performed.Results: Statistically significant plasma levels between CRC and healthy controls for PLA2G2A were found in 7/14 patients. A statistically significant correlation (PLA2G2A hyperconcentration) was observed at mRNA level between tumor and non-cancerous surrounding tissues. PLA2G2A protein over expression was observed in 23/30 (76.6%) cases, whereas 7/30 (23.4%) CRC tissues demonstrated low protein levels, respectively. PLA2G2A overall expression was strongly associated with tumor diameter (p=0.004), whereas other statistical significances were not assessed (stage: p=0.971, inflammatory infiltration: p=0.795; carcinoma location: p=0.340; differentiation grade: p=0.748; gender: p=0.369; ulceration: p=0.433). Statistically significant plasma levels between CRC and healthy controls for PLA2G3 were found in 12/14 patients. A statistically significant correlation (PLA2G3 hyperconcentration) was not observed at mRNA level between tumor and non-cancerous surrounding tissues. PLA2G3 protein over expression (increased immunostaining levels) was observed in 23/30 (76.6%) cases, whereas 07/30 (23.40%) CRCs tissues demonstrated low protein levels, respectively. PLA2G3 overall expression was strongly associated with the grade and tumor localization of the examined tumors (p=0.001, p=0.027, respectively), whereas other statistical significances were not assessed (inflammatory infiltration: p=0.846; stage: p=0.755; tumor diameter: p=0.300; ulceration: p=0.872; gender: p=0.902). No statistically significant plasma levels (however high in all 14 patients) between CRC and healthy controls for PRDX6 were found in 12/14 patients. High plasma levels of PRDX6-aiPLA2 were found in all CRC patients compared to healthy controls without however statistical significance. A statistically significant correlation (hypoconcentration) was observed at mRNA level between tumor and non-cancerous surrounding tissues (mRNA-PRDX6 levels reduced). PRDX-6 protein over expression was observed in 12/30 (40%) cases, whereas 18/30 (60%) CRC tissues demonstrated low to moderate protein levels, respectively. PRDX-6 overall expression was strongly associated with the stage of the examined tumors (p=0.011), whereas other statistical significances were not assessed (inflammatory infiltration: p=0.364; carcinoma location: p=0.93; differentiation grade: p=0.517; tumor diameter: p=0.983; ulceration: p=0.622). Conclusions: Elevated serum and mRNA levels and overexpression of PLA2G2A observed in a significant subset of CRC associated with advanced tumor growth (increased diameter) make it an interesting biomarker and potential therapeutic target in CRC. Elevated serum levels, non-statistical significance of mRNA and overexpression of PLA2G3 observed in a significant CRC subset in immunohistochemistry associated with aggressive biological behavior (tumor differentiation) and a kind of selectivity in localization of malignant substrate allow a broader research. The elevated serum concentration in both healthy controls and patients, the higher mRNA concentration in non-cancerous surrounding tissues of the tumor and the overexpression of PRDX-6 observed in a significant subset of CRC related to aggressive biological behavior (advanced stage) provide material for a more extensive research of the enzyme regarding redox effects in the primary CRC or during chemotherapy.

Σκοπός: Οι φωσφολιπάσες Α2 (PLA2) είναι ένζυμα που ρυθμίζουν το μεταβολισμό των φωσφολιπιδίων υδρολύοντάς τα σε λιπαρά οξέα. Η υπεροξυοξειδοαναγωγάση-6 (PRDX6) είναι πρωτεΐνη που δρα ως αντιοξειδωτικό ένζυμο, εμπλέκεται κυρίως στη μείωση των επιπέδων του ενδοκυτταρικού υπεροξειδίου του υδρογόνου και την επιδιόρθωση κυτταρικών μεμβρανών και με δραστικότητα φωσφολιπάσης Α2. Παίζουν ρόλο στη κυτταρική σηματοδότηση, στη φλεγμονή, στην αθηροσκλύρηνση και στον καρκίνο. Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε την έκφραση των PLA2G2A, PLA2G3, PRDX-6 στο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου (ΚΠΕ). Μέθοδοι: Mελετήθηκε η γονιδιακή/πρωτεϊνική έκφραση σε ιστικό και πλασματικό επίπεδο με προσδιορισμό ολικής πρωτεΐνης με την μέθοδο Lowry, την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήγμα πολυακρυλαμίδιου υπό μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE), την ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Immunoblotting, IB), την απομόνωση ολικού RNA, τον ποσοτικό προσδιορισμό περιεκτικότητας και έλεγχο καθαρότητας RNA, την σύνθεση cDNA με αντίστροφη μεταγραφή του mRNA (Reverse Transcription, RT) και ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR) σε 14 ασθενείς με ΚΠΕ με μέσο όρο ηλικίας 73.5 έτη (53-91). Επιπλέον μελετήθηκε μια σειρά από τριάντα (n=30) μονωμένες με φορμαλίνη, ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές ιστού πρωτογενούς ΚΠΕ ασθενών με μέσο όρο ηλικίας 77 έτη (53-90). Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημεία και ψηφιακή ανάλυση εικόνας (Digital Image Analysis). Αποτελέσματα: Επίπεδα πλάσματος στατιστικά σημαντικά σε σχέση με υγιείς μάρτυρες για την PLA2G2A αναδείχτηκαν σε 7/14 ασθενείς ενώ στατιστικά σημαντική συσχέτιση (υπερσυγκέντρωση PLA2G2A) αναδείχτηκε και σε επίπεδο mRNA σε σχέση με περιβάλλοντες του όγκου μη καρκινικούς ιστούς. Στην ανοσοϊστοχημεία, υπερέκφραση της πρωτεΐνης παρατηρήθηκε σε 23/30 (76,6%) περιπτώσεις, ενώ χαμηλή σε 7/30 (23,4%). Η συνολική έκφραση συσχετίστηκε ισχυρά με τη διάμετρο του όγκου (p=0,004) (μη στατιστικά σημαντικό στάδιο: p=0,971, φλεγμονώδης διήθηση: p=0,795, εντόπιση καρκινώματος: p=0,340, βαθμός διαφοροποίησης: p=0,748 φύλο: p=0,369, εξέλκωση: p=0,433). Επίπεδα πλάσματος στατιστικά σημαντικά σε σχέση με υγιείς μάρτυρες για την PLA2G3 αναδείχτηκαν σε 12/14 ασθενείς. Μη στατιστικά σημαντική συσχέτιση (υπερσυγκέντρωση) αναδείχτηκε σε επίπεδο mRNA σε σχέση με περιβάλλοντες του όγκου μη καρκινικούς ιστούς. Υπερέκφραση πρωτεΐνης PLA2G3 παρατηρήθηκε σε 23/30 (76,6%) περιπτώσεις, ενώ χαμηλή έκφραση σε 07/30 (23,40%). Η συνολική έκφραση του PLA2G3 συσχετίστηκε ισχυρά με τον βαθμό και τον εντοπισμό του όγκου των εξεταζόμενων όγκων (p=0,001, p=0,027, αντίστοιχα), ενώ άλλες στατιστικές σημαντικότητες δεν αναγνωρίστηκαν (φλεγμονώδης διήθηση: p=0,846, στάδιο: p=0,755, όγκος διάμετρος: p=0,300, εξέλκωση: p=0,872, φύλο: p=0,902).Υψηλά επίπεδα πλάσματος PRDX-6-aiPLA2 αναδείχτηκαν σε όλους τους ασθενείς χωρίς στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με υγιείς μάρτυρες. Στατιστικά σημαντική συσχέτιση (υπoσυγκέντρωση) αναδείχτηκε σε επίπεδο mRNA, με τα επίπεδα mRNA-PRDX6 μειωμένα σε σχέση με περιβάλλοντες του όγκου μη καρκινικούς ιστούς. Υπερέκφραση πρωτεΐνης PRDX-6 (αυξημένα επίπεδα ανοσοχρώσης) παρατηρήθηκε σε 12/30 (40%) περιπτώσεις, ενώ 18/30 (60%) ιστοί παρουσίασαν χαμηλά έως μέτρια επίπεδα πρωτεΐνης, αντίστοιχα. Η συνολική έκφραση του Prdx-6 συσχετίστηκε ισχυρά με το στάδιο των εξετασθέντων όγκων (p=0,011), ενώ άλλες στατιστικές σημαντικότητες δεν αναδείχτηκαν (φλεγμονώδης διήθηση: p=0,364, εντόπιση καρκινώματος: p=0,93, βαθμός διαφοροποίησης: p=0,517; διάμετρος όγκου: p=0,983, εξέλκωση: p=0,622). Συμπεράσματα: Αυξημένα επίπεδα ορού και mRNA και η υπερέκφραση του PLA2G2A που παρατηρείται σε ένα σημαντικό υποσύνολο ΚΠΕ που συσχετίζεται με την προχωρημένη εξέλιξη της ανάπτυξης του όγκου (αυξημένη διάμετρος) τον καθιστούν έναν ενδιαφέροντα παράγοντα ως βιοδείκτη και πιθανό θεραπευτικό στόχο στον ΚΠΕ. Αυξημένα επίπεδα ορού, μη στατιστική σημαντικότητα mRNA και η υπερέκφραση του PLA2G3 που παρατηρείται σε ένα σημαντικό υποσύνολο ΚΠΕ που σχετίζεται με επιθετική βιολογική συμπεριφορά (αποδιαφοροποίηση νεοπλασμάτων) και επίσης ένα είδος επιλεκτικότητας στον εντοπισμό του κακοήθους υποστρώματος επιτρέπουν περισσότερη και ευρύτερη έρευνα. Η παρουσία στον ορό τόσο υγιών μαρτύρων όσο και ασθενών, η μεγαλύτερη συγκέντρωση σε περιβάλλοντες του όγκου υγιείς ιστούς και η υπερέκφραση του Prdx-6 που παρατηρείται σε ένα σημαντικό υποσύνολο ΚΠΕ που συσχετίζεται με επιθετική βιολογική συμπεριφορά (προχωρημένο στάδιο) δίνουν υλικό για μια πιο ευρεία έρευνα του ενζύμου σε σχέση με τον ΚΠΕ και τα φαινόμενα οξειδοαναγωγών στον πρωτογενή όγκο ή κατά τη διάρκεια χημειοθεραπειών.