Mechanisms of sorting and targeting of transmembrane proteins: the case of plasma membrane transporters

Abstract

Transmembrane proteins constitute at least 1/3 of gene products in most organisms. Most of these proteins are important for communication between the cell or organelle with its surroundings (i.e., channels, transporters), or they mediate essential membrane functions (i.e., enzymes). In eukaryotic cells, the first step in the biogenesis of integral proteins of the plasma membrane (PM) is their co-translational translocation from ribosomes to the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). The neosynthesized proteins undergo quality control and are believed to be sorted in ER exit sites, then packed into COPII coated vesicles that fuse into the cis-Golgi and then reach trans-Golgi via Golgi maturation. The proteins are eventually translocated to the plasma membrane either directly or indirectly via endosomal compartments. However, new lines of evidence suggest the existence of unconventional protein secretion routes (UPS) in several organisms. Previous studies in filamentous fungi regarding protein secretion refer to research on polar cargoes, meaning proteins localized at the apical area of the fungus, due to the essentiality of polarity maintenance for the survival of the cell. Polar cargoes seem to follow the aforementioned secretion route, also known as “the conventional secretion route”. Thus, presence of alternative secretion routes was not mentioned before in filamentous fungi. In our lab, we recently established a novel unconventional secretion route to the PM in the model organisms Aspergillus nidulans, that challenges the concept of polar secretion for cargo trafficking. More specifically, we provided experimental evidence that nutrient transporters in A. nidulans, which are non-polarly distributed at the PM, translocate to the PM via a Golgi by-pass. Therefore, it was apparent that we questioned ourselves whether this unconventional route concerns only nutrient transporters sorting to the PM or it is a major secretion pathway for all non-polar cargoes in eukaryotic cells.Through this work, we gain insight on the mechanisms underlying non-polar cargoes translocation to the PM. For the first part of this thesis, we used PalI, a protein involved in ambient pH sensing, as a model cargo to elucidate the aforementioned matter. Fluorescence microscopy analysis of neosynthesized PalI subcellular localization shed light on the role of key proteins of conventional secretion in PalI trafficking to the PM. Overall, our results revealed that transmembrane proteins that are homogenously localized at the PM travel to their final destination via a Golgi-independent manner. In addition, this novel secretion pathway requires proper actin network, but not microtubules in contrast to the conventional secretion route.The second part of the study was focused on the role of major lipid groups in the trafficking of two extensively studied nutrient transporters in A. nidulans, UapA and AzgA. In particular, we showed that transcriptional reduction of genes involved in the biosynthesis pathways of ergosterol, phospholipids and sphingolipids leads to fungus growth arrest, however blockage of early and not late steps of the ergosterol biosynthesis pathway had detrimental effects on transporters proper localization to the PM. In addition, we observed that UapA was more sensitive to modification of PM lipid content than AzgA. Surprisingly, transport kinetics of both transporters was not affected in none of the biosynthesis lipid mutants. Overall, our results pointed out that the role of specific membrane lipids on transporter biogenesis and function in vivo is transporter-dependent.

Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες αποτελούν τουλάχιστον το 1/3 των κυτταρικών προϊόντων στους περισσότερους οργανισμούς. Οι πλειοψηφία αυτών των πρωτεϊνών είναι σημαντικές για την επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων ή των οργανιδίων με το περιβάλλον τους (π.χ., κανάλια, μεταφορείς), ή εμπλέκονται σε σημαντικές μεμβρανικές λειτουργίες (π.χ., ένζυμα). Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, το πρώτο βήμα βιογένεσης διαμεμβρανικών πρωτεϊνών της κυτταρικής μεμβράνης είναι η μετάφρασή τους από τα ριβοσώματα και η παράλληλη μεταφορά τους στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Οι νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες υποβάλλονται σε έλεγχο ποιότητας και συγκεντρώνονται σε πύλες εξόδου του ενδοπλασματικού δικτύου. Έπειτα πακετάρονται σε COPII κυστίδια τα οποία ενσωματώνονται στο cis-Golgi και διακινούνται ως το trans-Golgi μέσω ωρίμανσης του Golgi. Οι πρωτεΐνες τελικά μεταφέρονται στην πλασματική μεβράνη είτε άμεσα είτε έμμεσα με τη βοήθεια ενδοσωμάτων.Παρόλα αυτά, νέα επιστημονικά δεδομένα προτείνουν την ύπαρξη μη συμβατικών εκκριτικών μονοπατιών πρωτεϊνών σε διάφορους οργανισμούς. Μελέτες προηγούμενων ετών σε νηματώδεις μύκητες σχετικά με την έκκριση πρωτεϊνών αναφέρονται σε πρωτεΐνες τοπολογία στην άκρη της υφής (polar cargo) λόγω της σημαντικότητας της διατήρησης πολικότητας για την επιβίωση του κυττάρου. Οι πολικές αυτές πρωτεΐνες φαίνεται να ακολουθούν τη "συμβατική εκκριτική οδό" που προαναφέρθηκε. Επομένως, η ύπαρξη μη συμβατικών εκκριτικών μονοπατιών δεν είχε αναφερθεί ως τώρα για τους νηματώδεις μύκητες. Στο εργαστήριό μας, πρόσφατα ανακαλύψαμε ένα νέο μονοπάτι έκκρισης πρωτεϊνών στον οργανισμό μοντέλο Aspergillus nidulans, η οποία αμφισβητεί το συμβατικό μονοπάτι. Πιο συγκεκριμένα, παραθέσαμε πειραματικά δεδομένα που αποδεικνύουν ότι οι μεταφορείς θρεπτικών συστατικών στον A. nidulans, οι οποίοι βρίσκονται σε όλο το μήκος της μεμβράνης του κυττάρου και όχι μόνο στο ακραίο τμήμα της, μεταφέρονται στη μεμβράνη παρακάμπτοντας το Golgi. Επομένως, ήταν λογικό να αναρωτηθούμε αν αυτό το μη συμβατικό μονοπάτι έκκρισης πρωτεϊνών αφορά μόνο τους μεταφορείς θρεπτικών συστατικών ή αποτελεί ένα κύριο μονοπάτι έκκρισης για όλες τις μη πολικές πρωτεΐνες στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Μέσω αυτής της διδακτορικής διατριβής, αποκτήσαμε πληροφορίες για τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην μεταφορά των μη πολικών πρωτεϊνών στη μεμβράνη του κυττάρου. Στο πρώτο τμήμα της διατριβής, χρησιμοποιήσαμε το PalI, μία πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην ανίχνευση του περιβαλλοντικού pH, ως πρωτεΐνη-μοντέλο έτσι ώστε να απαντήσουμε στο ερώτημα που προαναφέρθηκε. Μέσω ανάλυσης μικροσκοπίας φθορισμού μελετήσαμε την υποκυτταρική μεταφορά του νεοσυντιθέμενου PalI και αποκτήσαμε πληροφορίες σχετικά με το ρόλο πρωτεϊνών σημαντικών για το συμβατικό εκκριτικό μονοπάτι, στην έκκριση του PalI. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που τοποθετούνται σε όλο το μήκος της μεμβράνης του κυττάρου μεταφέρονται στον τελικό τους προορισμό παρακάμπτοντας το Golgi. Επιπλέον, αυτή η νέα εκκριτική οδός απαιτεί το λειτουργικό δίκτυο ακτίνης αλλά όχι τους μικροσωληνίσκους σε αντίθεση με τη συμβατική οδό.Το δεύτερο τμήμα της διατριβής εστιάζει στο ρόλο κύριων λιπιδικών ομάδων στη διακυτταρική μεταφορά δύο εξαιρετικά μελετημένων μεταφορέων θρεπτικών συστατικών του A. nidulans, των UapA και AzgA. Συγκεκριμένα, δείξαμε ότι η μεταγραφική μείωση εργοστερόλης, φωσφολιπιδίων και σφιγγολιπιδίων αναστέλλει την ανάπτυξη του μύκητα, όμως είχε σοβαρά αρνητικά αποτελέσματα στην τοποθέτηση των μεταφορέων στη μεμβράνη του κυττάρου μόνο όταν διακόπτουμε το μονοπάτι σύνθεσης εργοστερόλης στα αρχικά του βήματα. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι ο UapA ήταν πιο ευαίσθητος στις αλλαγές της λιπιδικής σύστασης της μεμβράνης σε σχέση με τον AzgA. Παραδόξως, η ικανότητα μεταφοράς υποστρώματος και των δύο μεταφορέων δεν επηρεάστηκε σε καμία από τις μεταλλαγές λιπιδίων. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας επισημαίνουν ότι ο ρόλος συγκεκριμένων μεμβρανικών λιπιδίων στη βιογένεση και λειτουργία μεταφορέων in vivo εξαρτάται από τον ίδιο το μεταφορέα.