Impact of water relations on the production, ecological fitness and stability of the biocontrol fungus Metarhizium anisopliae

Abstract

The aim of this work was the production of high numbers of propagules of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae with quality characteristics conferring enhanced efficiency as a commercial biological control agent product i.e. high germination capacity under low water availability, good storage stability and enhanced pathogenicity. To this end modifications of cultural conditions were employed. Water-stress on solid substrate fermentation reduced the number of conidial production but resulted in enhancement of germination capacity. Conidial production and germination was also considerably influenced by the type of solid substrate (bulgar wheat, millet grain). Intracellular accumulation of endogenous reserves of selected polyols, which have been linked with intracellular osmoregulation and subsequent enhancement of germination under conditions of restricted water availability, was altered by such substrate modifications. Imposed water-stress in liquid culture resulted in increased blastospore production in the 0.998 to 0.96 water activity (aw) range when ionic solutes (NaCl, KCl) were used for medium modification but in a lot narrower range (0.998-0.98 aw) when PEG 200 was used. Water-stress resulted in the production of modified blastospores with increased levels of the low molecular weight polyol erythritol. Higher amounts of endogenous polyols were retained intracellularly when modified blastospores were osmoprotected after harvest compared to subjection to hypo-osmotic shock by washing with water. Intracellular polyol pattern of blastospores was also affected by nitrogen source, pH and aw-modifying solute as well as by the interaction between these factors. Optimum conditions for increased erythritol accumulation occurred when ionic solutes (NaCl, KCl) were used for aw modification and in pH range between 6.8-8. Total endogenous protein was also enhanced under the same conditions. Germination of blastospores produced under these conditions was between 62 and 89% under conditions of water-stress (0.96 aw). On the other hand blastospores with lower amounts of erythritol and total protein content had decreased germination (8-67%). Osmoprotection of such modified blastospores resulted in increased storage stability as wet pastes and freeze-dried preparations. Destruxin A production was not affected by osmoprotection and protease activity was enhanced by osmoprotection using PEG 200 isotonic solution but not by ionic (NaCl) or carbohydrate (glucose) isotonic solutions. Modified blastospores were not more infective than unmodified ones under 100% R.H.

Στόχος αυτής της εργασίας ήταν η παραγωγή υψηλoύ αριθμού σπορίων του εντομοπαθογόνου μήκυτα Metarhizium anisopliae με ποιοτικά χαρακτηριστικά που προσδίδουν αυξημένη αποτελεσματικότητα ως προϊόν εμπορικού βιολογικού φυτοπροστατευτικού προϊόντος, δηλαδή υψηλή βλαστική ικανότητα σε συνθήκες υδατικού στρες (μειωμένη σχετική υγρασία), καλή σταθερότητα αποθήκευσης και βελτιωμένη αποτελεσματικότητα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τροποποιήσεις συνθηκών καλλιέργειας σε στερεό και υγρό θρεπτικό υπόστρωμα. Η εφαρμογή υδατικού στρες σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα μείωσε τον αριθμό της παραγωγής κονιδίων αλλά οδήγησε σε ενίσχυση της βλαστικής τους ικανότητας. Η παραγωγή και η βλάστηση των κονιδίων επηρεάστηκε επίσης σημαντικά από τον τύπο του στερεού υποστρώματος (κόκκος σιτάρι, κόκκος κεχρί). Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση πολυολών, οι οποίες έχουν συνδεθεί με ενδοκυτταρική οσμορύθμιση και επακόλουθη ενίσχυση της βλάστησης σπορίων υπό συνθήκες χαμηλής σχετικής υγρασίας, μεταβλήθηκε από τέτοιες τροποποιήσεις υποστρώματος. Η εφαρμογή υδατικού στρες σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη παραγωγή βλαστοσπορίων στο εύρος 0,998 έως 0,96 water activity (aw) όταν για την εφαρμογή υδατικού στρες χρησιμοποιήθηκαν ιοντικές ουσίες (NaCl, KCl), αλλά σε πολύ στενότερο εύρος (0,998-0,98 aw) όταν χρησιμοποιήθηκε πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG 200). Η εφαρμογή υδατικού στρες σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή βλαστοσπορίων με αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης ερυθριτόλης χαμηλού μοριακού βάρους. Μεγαλύτερες ποσότητες πολυολών διατηρήθηκαν ενδοκυτταρικά όταν τα παραγόμενα υπό υδατικό στρες βλαστοσπόρια συγκομίστηκαν με τη χρήση ισοτονικών διαλυμάτων ίδιου υδατικού δυναμικού με το ενδοκυτταρικό τους δυναμικό σε σύγκριση με την χρήση νερού (οσμωτικό σοκ). Οι συγκεντρώσεις και ο τύπος πολυολών των βλαστοσπορίων ενδοκυτταρικά επηρεάστηκε επίσης από την πηγή αζώτου, το pH και την ουσία που χρησιμοποιήθηκε για εφαρμογή υδατικού στρες στο υγρό θρεπτικό υπόστρωμα, καθώς και από την αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των παραγόντων. Οι βέλτιστες συνθήκες για αυξημένη συγκέντρωση ερυθριτόλης ήταν με τη χρήση ιοντικών ουσιών (NaCl, KCl) και σε περιοχή pH μεταξύ 6,8-8. Η συνολική συγκέντρωση ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης αυξήθηκε επίσης υπό τις ίδιες συνθήκες. Η βλάστηση των βλαστοσπορίων που παρήχθησαν κάτω από αυτές τις συνθήκες ήταν μεταξύ 62 και 89% υπό συνθήκες υδατικού στρες (0,96 aw). Από την άλλη, τα βλαστοσπόρια με χαμηλότερες συγκεντρώσεις ερυθριτόλης και περιεκτικότητας ολικής πρωτεΐνης είχαν μειωμένη βλάστηση (8-67%). Η ωσμοπροστασία των παραγόμενων υπό συνθήκες υδατικού στρες βλαστοσπορίων είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη σταθερότητα αποθήκευσης ως υγρές πάστες και λυοφιλοποιημένα παρασκευάσματα. Η παραγωγή της δεστροξίνης Α δεν επηρεάστηκε από την ωσμοπροστασία και η δραστηριότητα της πρωτεάσης αυξήθηκε από την ωσμοπροστασία όταν χρησιμοποιήθηκε ισοτονικό διάλυμα με PEG 200 αλλά όχι από ισοτονικά διαλύματα ιοντικών ουσιών (NaCl) ή υδατανθράκων (γλυκόζης). Τα τροποποιημένα βλαστοσπόρια δεν ήταν πιο μολυσματικά από τα μη τροποποιημένα κάτω από 100% σχετική υγρασία.