Targeting DNA double-strand break repair sensitises HNSCC cells to x-rays and proton radiation

Abstract

Ionizing radiation (IR) induces various DNA lesions, with the double strand breaks (DSB) be the most threatening to the cell survival. The two main mechanisms that detect and repair DSBs are the non-homologous end joining (NHEJ) and the homologous recombination (HR), which are driven by the DNA repair protein kinases Ataxia-telangiectasia mutated (ATM), ATM and Rad3 related (ATR), and the catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs). Specific inhibitors suppressing these proteins, restricting the DNA repair process are studied for numerous cancer types. The aim of the work described in this thesis was to investigate and understand the effect of inhibition of ATM, ATR, and DNA-PKcs protein kinases on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines in combination with either X – rays or Proton beams (PB). A large proportion of HNSCC is driven by human papillomavirus (HPV). Interestingly, clinical data suggest that HPV-positive patients have a better prognosis compared to HPV-negative ones. This was reflected in in vitro studies, where HPV-positive HNSCC cell lines were more sensitive to IR compared to the HPV-negative ones. Three inhibitors were used, KU-55933, VE-821, and NU7441, inhibiting ATM, ATR, and DNA-PKcs respectively, to investigate the impact of inhibition alone or in combination with IR, inHPV-positive and HPV-negative HNSCC cell lines (UMSCC74A, UMSCC6, UMSCC47, UPCISCC090, FaDu, and A253). Cell survival and growth was analysed using 2D clonogenic and 3D spheroid growth assays. Also, the impact of the inhibitors on the respective enzyme target was analysed by immunoblotting, and on DSB signaling by Immunofluorescence (IF) staining and DSB repair foci analysis of histone γH2AX, 53BP1, and Rad51. My results exhibited reduced phosphorylation levels on the inhibited proteins up to 24 h following exposure to IR, thus demonstrating the effectiveness of the inhibitors at the protein level. Moreover, inhibitor and IR treatment altered all threeDSB repair foci formation, where decreased levels but also persistent foci were observed. Finally, inhibition of ATM, ATR, and particularly DNA-PKcs, caused a significantreduction in HNSCC cell proliferation in 2D as well as in 3D, post-IR, with less of an impact on the most radiosensitive HPV-positive cell lines. Cumulatively, my results demonstrated that targeting DNA DSB repair via NHEJ or HR can exacerbate the impact of x – rays and PB in radiosensitising HNSCC cell models, constituting a promising combination treatment for HNSCC.

Η ιοντίζουσα ακτινοβολία (ΙR) προκαλεί διάφορες βλάβες στο DNA, εκ των οποίων οι ρήξεις διπλής έλικας (DSB) είναι από τις πιο απειλητικές για την επιβίωση των κυττάρων. Οι δύο βασικοί μηχανισμοί που εντοπίζουν και επιδιορθώνουν τις DSBs είναι ο μηχανισμός ένωσης μη-ομόλογων άκρων (NHEJ) και ο μηχανισμός ομόλογου ανασυνδυασμού (HR), που οδηγούνται από τις πρωτεϊνικές κινάσες επιδιόρθωσης του DNA Ataxia telangiectasia mutated (ATM), ATM and Rad3 related (ATR), και catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs). Εξειδικευμένοι αναστολείς που καταστέλλουν την δράση αυτών των πρωτεϊνών, εμποδίζοντας την διαδικασία επιδιόρθωσης του DNA, χρησιμοποιούνται σε μελέτες για αρκετούς τύπους καρκίνου. Ο στόχος της παρούσης διατριβή ήταν να διερευνηθεί και να κατανοηθεί η επίδραση της αναστολής των πρωτεϊνικών κινασών ATM, ATR και DNA-PKcs σε καρκινικά πλακώδη κύτταρα κεφαλής και λαιμού (HNSCC) σε συνδυασμό είτε με ακτίνες Χ είτε με δέσμες πρωτονίων (PB). Ένα μεγάλο ποσοστό του HNSCC προκαλείται από τον ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV). Πάρα ταύτα, κλινικά δεδομένα υποδηλώνουν ότι οι HPV-θετικοί ασθενείς έχουν καλύτερη πρόγνωση σε σύγκριση με HPV-αρνητικούς ασθενείς. Αυτό αντικατοπτρίζεται και σε μελέτες in vitro, όπου HPV-θετικά κύτταρα HNSCC ήταν πιο ευαίσθητα στην ΙR σε σύγκριση με τα HPV-αρνητικά κύτταρα. Χρησιμοποιήθηκαν τρεις αναστολείς, οι KU-55933, VE-821 και NU7441, που αναστέλλουν τις ATM, ATR και DNA-PKcs αντίστοιχα, για τη διερεύνηση της επίδρασης είτε της αναστολής αυτής καθαυτής είτε σε συνδυασμό με έκθεση σε IR, σε HPV-θετικές και HPV-αρνητικές κυτταρικές σειρές HNSCC ( UMSCC74A, UMSCC6, UMSCC47, UPCISCC090, FaDu και A253). Η επιβίωση και η ανάπτυξη των κυττάρων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας 2D δοκιμασία σχηματισμού αποικιών (colony formation assay) και 3D δοκιμασία ανάπτυξης σφαιριδίων (spheroid growth assay). Επίσης, με ανοσοστύπωση αναλύθηκε η επίδραση των αναστολέων στις πρωτεϊνικές κινάσες-στόχους, και με χρώση ανοσοφθορισμού (IF) αναλύθηκε η επίδραση τους στη σηματοδότηση και επισκευή DSB μέσω των εστιών ιστόνης γH2AX, 53BP1 και Rad51. Τα αποτελέσματά μου έδειξαν μειωμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης στις ανεσταλμένες πρωτεΐνες έως και 24 ώρες μετά την έκθεση σε IR, αποδεικνύοντας έτσι την αποτελεσματικότητα των αναστολέων σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Επιπλέον, η συνδυαστική θεραπεία με αναστολέα και έκθεση σε IR άλλαξε τον σχηματισμό και των τριών εστιών επιδιόρθωσης DSB, όπου παρατηρήθηκαν μειωμένα επίπεδα αλλά και επίμονες εστίες. Τέλος, ο συνδυασμός IR και αναστολής των ATM, ATR, και ιδιαίτερα του DNA-PKcs, προκάλεσε σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HNSCC σε 2D καθώς και σε 3D, με μικρότερη επίδραση στις πιο ραδιοευαίσθητες HPV-θετικές κυτταρικές σειρές. Συνολικά, τα αποτελέσματά μου έδειξαν ότι η στόχευση επιδιόρθωσης DNA DSB μέσω NHEJ ή HR μπορεί να επιδεινώσει τον αντίκτυπο των ακτίνων Χ και του PB, ακτινο-ευαισθητοποιώντας μοντέλα κυττάρων HNSCC, αποτελώντας μια πολλά υποσχόμενη συνδυαστική θεραπεία για HNSCC.