Acoustic based technologies combined with enzymatic amplification for the analysis of point mutations in Tissue and Liquid biopsy

Abstract

Although biosensors hold their roots in the early nineteen-sixties, a great increase in the number of publications refer on this topic was recorded after the nineteen-eighties decade. Moreover, the increasing demand for inexpensive, simplified, sensitive and reliable sensors lead the biosensors market to a significant growth with a predicted compound annual growth rate (CAGR) of 7.3% for the years 2020 - 2027. Biosensors are applied in a wide range of fields including, healthcare and medical diagnostics and is expected to be positively affected by the new trend of precision medicine and the evenly huge market of Liquid biopsy.Regular screening of cancerous point mutations is of great importance for efficient cancer management and treatment selection. Although excellent techniques like next-generation sequencing and the ultrasensitive droplet digital PCR have been developed, these techniques are lacking in fastness, simplicity and cost-effectiveness. The work presented here focuses on the development of new diagnostic approaches for the detection of ultralow concentrations of cancerous point mutations in human DNA utilizing acoustic biosensors combined with molecular amplification assays. Firstly, we present a universal acoustic methodology that involves the direct immobilization of biotinylated DNA targets on the sensor surface followed by liposome-based acoustic detection. Liposomes, are large nanoparticles (here 200nm) acting as acoustic energy-dissipation signal enhancers. For the DNA immobilization, we developed a surface chemistry composed of biotinylated-BSA and NAv; the substrate was reproducible and was successfully validated for its specificity and stability upon liposome and crude sample additions, respectively. While for the above we used a standard QCM-D device and a 5 MHz QCM sensor, a novel High Fundamental Frequency QCM (HFF-QCM) array of 24 miniaturized sensors operating at 150 MHz and a new acoustic device were also tested. The array permitted the faster and more cost-effective analysis of up to six different samples and the extraction of up to 24 measurements. The above-mentioned acoustic methodology, i.e., b-BSA/NAv and liposomes for immobilization and detection of DNA targets using the QCM-D device, was firstly combined with a PCR-free DNA amplification assay, the Ligase Chain Reaction (LCR). For the LCR we used probes modified with biotin and cholesterol to produce LCR products ready for immobilization on the NAv-coated sensor and acoustic detection. Following extended optimization, the detection of 3300 DNA molecules carrying the BRAF V600E point mutation was achieved. However, the overall assay suffered from some limitations concerning the target-independent ligated by-products that occurred during the LCR, leading to low sensitivity and decreased specificity. To overcome the problem of the low sensitivity and specificity Allele-Specific PCR (AS-PCR) was employed as an alternative method for DNA amplification. AS-PCR combined with acoustic detection improved the limit of detection down to 1 copy of mt target in an excess of 10000 wt molecules, otherwise with a sensitivity of 0.01%, using genomic DNA carrying the BRAF V600E point mutation. For the amplification, we again used primers modified with biotin and cholesterol and for the acoustic detection, we employed the 150 MHz biochip array with great success. Since the initial protocol developed for the detection of the BRAF V600E mutation gave only qualitative results, the assay was further optimized and applied to the analysis of KRAS G12D mutation achieving both qualitative and quantitative results with a sensitivity of 0.05%. Finally, the assay was validated for the detection of both point mutations in real FFPE-tissue and plasma samples obtained from melanoma, colorectal and lung and cancer patients. The obtained results were compared with those recorded from the standard methods used for tissue and liquid biopsy i.e., Sanger sequencing and droplet-digital PCR.

Παρόλο που ο πρώτος βιοαισθητήρας ανακαλύφθηκε το 1962 από τον Leyland C. Clark, εκθετική άνοδος στις δημοσιεύσεις του αντίστοιχου τομέα καταγράφηκε μετά τα τέλη της δεκαετίας του 1980. Επιπλέον, η όλο και αυξανόμενη ζήτηση για οικονομικούς, εύχρηστους, ευαίσθητους και αξιόπιστους αισθητήρες έχει οδηγήσει σε μεγάλη ανάπτυξη της αγορά των βιοαισθητήρων, η οποία για το έτος 2020 υπολογίστηκε στα 26 δισεκατομμύρια δολάρια ενώ αναμένεται να ανέλθει στα 43,4 δισεκατομμύρια δολάρια το 2027 με προβλεπόμενο σύνθετο ετήσιο ρυθμό ανάπτυξης (CAGR) 7,3%. Ο κλάδος των βιοαισθητήρων βρίσκει εφαρμογή σε ένα ευρύ φάσμα τομέων, όπως αυτόν της ιατρικής διάγνωσης και αναμένεται να επηρεαστεί θετικά από τη νέες αναδυόμενες τάσεις της ιατρικής ακριβείας και της επίσης πολύ μεγάλης και ραγδαίας αναπτυσσόμενης αγοράς που αφορά την Υγρή βιοψία.Σύμφωνα με τα δεδομένα, προκειμένου να επιτευχθεί η πλέον αποτελεσματική αντιμετώπιση του καρκίνου, απαραίτητη είναι η έγκαιρη και τακτική ταυτοποίηση τυχόν καρκινικών μεταλλάξεων τόσο για τη σωστότερη διάγνωση όσο και για την επιλογή καταλληλότερης θεραπείας και για έλεγχο της ανταπόκρισης του ασθενούς σε αυτήν. Αν και τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί εξαιρετικές τεχνικές για την αξιόπιστη ταυτοποίηση των καρκινικών μεταλλαγών, όπως η αλληλούχιση DNA νέας γενιάς (next-generation sequencing) και η ψηφιακή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης τεχνολογίας σταγονιδίων (digital droplet PCR, ddPCR), αυτές οι τεχνικές εξακολουθούν να έχουν σημαντικά υψηλό κόστος και στερούνται απλότητας και ταχύτητας ως προς την έκδοση των αποτελεσμάτων. Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται στην ανάπτυξη νέων διαγνωστικών μεθόδων για την ανίχνευση εξαιρετικά χαμηλών συγκεντρώσεων ανθρώπινου καρκινικού DNA και των φερόμενων σε αυτό σημειακών μεταλλαγών. Η ανίχνευση επιτυγχάνεται με τη χρήση ακουστικών βιοαισθητήρων σε συνδυασμό με μοριακές μεθόδους ενίσχυσης του DNA.Σε πρώτη φάση, επικεντρωθήκαμε στην ανάπτυξη μία καθολικής μεθόδου για την ακουστική ανίχνευση του DNA, η οποία περιλαμβάνει την άμεση ακινητοποίηση μικρών συγκεντρώσεων (pM - nM) βιοτινυλιωμένου DNA στην επιφάνεια του αισθητήρα ακολουθούμενη από την ανίχνευσή του μέσω λιποσωμάτων. Τα λιποσώματα, είναι μεγάλα μόρια (για παράδειγμα εδώ γίνεται χρήση λιπωμάτων διαμέτρου 200 nm) που δρουν ως ενισχυτές του ακουστικού σήματος αυξάνοντας κατά πολύ τη διάχυση ενέργειας (energy dissipation). Για την ακινητοποίηση του DNA πάνω στη επιφάνεια του αισθητήρα, αναπτύξαμε ένα υπόστρωμα αποτελούμενο από βιοτινυλιωμένη-BSA και νιουτραβιδίνη (ΝΑv); η NAv χρησιμεύει στην άμεση και αυθόρμητη ακινητοποίηση του βιοτινυλιωμένου DNA μέσω της πολύ ισχυρής συγγένειας που έχει η βιοτίνη για τη NAv. Το DNA είναι ειδικά σχεδιασμένο, έτσι ώστε εκτός από τη βιοτίνη στο ένα άκρο, να φέρει ένα μόριο χοληστερόλης στο άλλο άκρο του. Έτσι, η πρόσδεση των λιποσωμάτων στο DNA επιτυγχάνεται μέσω της χοληστερόλης η οποία αυθόρμητα εισέρχεται στη λιπιδική διπλοστοιβάδα τους. Το υπόστρωμα ελέγχθηκε ως προς (α) την επαναληψιμότητα στη σύνθεσή του, (β) την τυχόν μη ειδική πρόσδεση των λιποσωμάτων σε αυτό απουσίας DNA και (γ) την σταθερότητά του κατά την εισαγωγή μη προ-καθαρισμένων μοριακών αντιδράσεων. Ενώ για τα παραπάνω πειράματα χρησιμοποιήσαμε την τυπική QCM-D συσκευή και έναν QCM αισθητήρα των 5 MHz, δοκιμάσαμε, επίσης, αισθητήρες QCM υψηλής θεμελιώδους συχνότητας (HFF-QCM) σε συνδυασμό με μια νέα ακουστική συσκευή. Αναφορικά με αυτό, ήταν μία διάταξη 24 μικροσκοπικών αισθητήρων που λειτουργούν στα 150 MHz. Η διάταξη αυτή, επέτρεπε την ταχύτερη και οικονομικότερη ανάλυση έως και έξι διαφορετικών δειγμάτων και την εξαγωγή έως και 24 μετρήσεων. Η προαναφερθείσα ακουστική μεθοδολογία, δηλαδή, βιοτινυλιωμένη-BSA/NAv σε συνδυασμό με τα λιποσώματα για την ακινητοποίηση και την ανίχνευση των DNA στόχων χρησιμοποιώντας τη συσκευή QCM-D, συνδυάστηκε αρχικά με μια μοριακή αντίδραση ενίσχυσης του DNA χωρίς PCR, την αλυσιδωτή αντίδραση λιγάσης (LCR). Για την LCR χρησιμοποιήσαμε ολιγονουκλεοτίδια (probes) τροποποιημένα με βιοτίνη και χοληστερόλη προκειμένου να παράγουμε τροποποιημένα προϊόντα LCR έτοιμα για ακινητοποίηση στον αισθητήρα και ακουστική ανίχνευση. Έπειτα από εκτεταμένη βελτιστοποίηση της όλης μεθοδολογίας, καταφέραμε να ανιχνεύσουμε 3300 μόρια DNA που φέρουν τη σημειακή μετάλλαξη BRAF V600E. Ωστόσο, η συνολική δοκιμασία έπασχε από ορισμένους περιορισμούς, όπως τα παραπροϊόντα που δημιουργούνταν κατά τη διάρκεια της αντίδρασης ανεξάρτητα από την παρουσία του DNA στόχου, οδηγώντας σε περιορισμένη ευαισθησία και μειωμένη ειδικότητα της αντίδρασης. Από την άλλη πλευρά, η αλληλοειδική PCR (AS-PCR) σε συνδυασμό με την προαναφερθείσα ακουστική μεθοδολογία βελτίωσε το όριο ανίχνευσης σημαντικά, επιτρέποντας την ανίχνευση 1 μορίου γενωμικού DNA στόχου που φέρει τη BRAF V600E μετάλλαξη σε περίσσεια 10000 μορίων αγρίου τύπου, αλλιώς με ευαισθησία 0,01%. Για την ενίσχυση του μεταλλαγμένου DNA μέσω της PCR, χρησιμοποιήθηκαν και πάλι εκκινητές τροποποιημένοι με βιοτίνη και χοληστερόλη για την παραγωγή τροποποιημένων AS-PCR προϊόντων, ενώ για την ακουστική ανίχνευση, χρησιμοποιήθηκε το βιοτσίπ με τη διάταξη βιοαισθητήρων που λειτουργούν στα 150 MHz. Δεδομένου ότι το αρχικό πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε για την ανίχνευση της μετάλλαξης BRAF V600E παρείχε μόνο ποιοτικά αποτελέσματα, η τεχνική βελτιστοποιήθηκε περαιτέρω και εφαρμόστηκε για την ανάλυση της μετάλλαξης KRAS G12D επιτυγχάνοντας τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά αποτελέσματα με ευαισθησία 0,05%. Τέλος, η επιτυχής εφαρμογή και η αξιοπιστία της μεθόδου επικυρώθηκε με την ανίχνευση και των δύο σημειακών μεταλλάξεων σε πραγματικά δείγματα μονιμοποιημένου ιστού ενσωματωμένου σε παραφίνη (FFPE) και σε πραγματικά δείγματα πλάσματος προερχόμενα από ασθενείς με μελάνωμα, καρκίνο του παχέος εντέρου και καρκίνο του πνεύμονα. Τα λυφθέντα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά που καταγράφηκαν από τις κλασσικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται για βιοψία ιστού και υγρή βιοψία, δηλ. με την αλληλούχιση κατά Sanger και τη ddPCR.