The role of the replication licensing factor CDC6 in oncogenesis: a study in inducible cellular models

Abstract

Homeostasis is a fundamental feature of single and multi-cellular organisms that is maintained by cellular responses that counteract a plethora of deleterious intrinsic and extrinsic signals (Lloyd et al. 2001). Aberrations in the modulating pathways that govern these responses result in excess of damage, functional defects and disease emergence, including cancer (Gorgoulis and Halazonetis 2010). In cancer cells, one of the most frequently affected cellular functions is the proper execution of the cell cycle, which under specific circumstances can produce genomic instability (Negrini et al. 2010). This established hallmark of cancer is closely related to the dysfunction of the replication licensing machinery (Petrakis et al. 2016). Cell division cycle 6 (CDC6) is a pivotal molecule of this apparatus. Coordinated expression of CDC6, together with ORC and CDT1, facilitate timely loading of MCM2-7 onto the chromatin in G1 phase, forming the pre-replicative complex. This results in licensing of the replication origins once per cell cycle and ensuring the accurate duplication of the whole genome before cell division (Blow and Gillespie 2008). Moreover, CDC6 is engaged into the activation of checkpoints that regulate S phase and mitosis (Borlado and Mendez 2008).Interestingly, accumulating amount of data supports that deregulated expression of CDC6 exerts oncogenic activity. Particularly, it is frequently overexpressed in cancer, usually from its earliest stages, and is associated with poor prognosis (Williams et al. 1998,Karakaidos et al. 2004, Liontoset al. 2007, Sideridou et al. 2011). CDC6 overexpression results in re-replication and eventually in DNA damage and genomic instability (Vaziri et al. 2003, Liontoset al. 2007, Sideridou et al. 2011, Walteret al. 2016). Subsequent activation of DNA damage response checkpoints triggers the antitumor barriers of senescence and apoptosis (Bartkovaet al. 2006, Petrakis et al. 2016), while selective loss of p53 promotes malignant behavior (Karakaidos et al. 2004, Liontoset al. 2007, Halazonetiset al. 2008) and acquisition of mesenchymal traits through E-cadherin down-regulation, a hallmark of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) (Liontos et al. 2007, Sideridou et al. 2011). More recently, CDC6 has been shown to be involved in the transcription of rRNA (Huang, Xu et al. 2016) and CXCL12 (Petrakis et al. 2016).To investigate the role of CDC6 in oncogenesis our group has developed a prototypical non-malignant epithelial cellular system overexpressing CDC6 in an inducible manner in Human Bronchial Epithelial Cells (HBECs), a non-cancerous lung cell line (Komseli et al. 2018). The immortalization of the cells generated was achieved with a combined expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) and an ectopic mutant cyclin dependent kinase 4 (CDK4), maintaining their epithelial phenotype and preserving intact the p53 checkpoint pathway (Ramirez et al., 2004). Thus, they represent a valuable tool for studying carcinogenesis, since the majority of malignancies have epithelial origin and lung cancer is among the most frequent cancer types in clinics. CDC6 forced expression resulted in the activation of senescence after 6 days, whereas protracted overexpression enabled the cells to evade senescence in about 30 days, following CDC6 induction, resulting in the emergence of aggressive clones with high invasive potential (Komseli et al. 2018). Nevertheless, the events leading to the escape from senescence were not clear until now. Hence, the aim of the present PhD thesis is to interrogate for the mechanism(s) involved in this process. Upon CDC6 induction, DNA damage occurred and subsequently repair mechanisms were triggered. However, the nature of the DNA repair pathways that were activated resulted in erroneous repair of the genome. Thus, genetic alterations occurred and among them, the most prominent defect discovered, is a large chromosomal inversion at chromosome 3p. The affected chromosomal locus located in this inversion, concerns the BHLHE40 coding locus. BHLHE40 is a transcription factor involved in the daily regulation of the circadian clock (Kato et al. 2014, Sato et al. 2016). Interestingly, this factor targets >68% of the differentially regulated genes found between the non-induced and the cells that escaped senescence. Furthermore, BHLHE40 is overexpressed in the escaped cells and plays a crucial role in the preservation of their phenotype, as its down-regulation induces cell death. For this purpose, we decided to generate an artificial genetic inversion at chromosome 3p, mimicking the naturally selected inversion. As expected, the cells bearing the inversion bypassed senescence. Similar results were obtained after introducing a BHLHE40-expressing vector into the HBECs. Interestingly, remodeling of the BHLHE40 3D chromatin structure coincides with its activation. The above mentioned results indicate that CDC6 can be a promising target for cancer inhibition. Given that CDC6 overexpression also correlates with adverse outcome in cancer patients, we down-regulated CDC6 in breast cancer cell lines that overexpress this replication licensing factor. Our results suggest that CDC6 abrogation induces DNA damage, cellular senescence and cell death. Importantly, cells were eliminated via mitotic catastrophe in the triple-negative cell line, which coincides with the abrogation of G2/M checkpoint. Overall, the main aim of the present PhD thesis was to uncover the underlying mechanistic basis, responsible for the escape from oncogene-induced senescence. Early events occurring during the first few days of CDC6 induction proved to play a pivotal role in the escape phenomenon/process and particularly genetic alterations revealed to be of high importance for the emergence of aggressive cell clones. Among them an inversion in chromosome 3p led to the rearrangement of the 3D chromatin structure and to the subsequent overexpression of the BHLHE40 transcription factor. This event, finally, modified the expression pattern of a series of genes and hence promoted the escape from the anti-tumor barrier of senescence. Considering that CDC6 is a triggering event for malignant transformation and is also related to poor overall survival, inhibiting its function in cancer patients can be a promising therapeutic strategy. On the other hand, an alternative therapeutic approach could exploit the concurrent elimination of senescent cells with senolytic drugs, in parallel with the use of traditional chemotherapeutic schemes that are known to induce senescence.

Η ομοιόσταση συνιστά θεμελιώδη ιδιότητα των οργανισμών και εξασφαλίζεται μέσω πληθώρας κυτταρικών αποπκρίσεων έναντι ενδογενών και εξωγενών παραγόντων. Η διαταραχή των μηχανισμών που ελέγχουν τις διαδικασίες αυτές οδηγεί στη συσσώρευση βλαβών και γενικά στην απορρύθμιση της κυτταρικής λειτουργίας με επακόλουθο την εμφάνιση νόσων, όπως ο καρκίνος. Στους όγκους παρατηρείται συχνά διατάραξη της ομαλής εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, που υπό προϋποθέσεις μπορεί να οδηγήσει στην πρόκληση γενωμικής αστάθειας. Η τελευταία έχει καθιερωθεί τα τελευταία χρόνια ως χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων και σχετίζεται στενά με την διαταραχή του μηχανισμού αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA.Ο παράγοντας CDC6 αποτελεί κύριο συστατικό αυτής της λειτουργίας. Το CDC6 μαζί με τις πρωτεΐνες ORC και CDT1 διευκολύνουν την στρατολόγηση των παραγόντων MCM2-7 στη χρωματίνη κατά την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου, προκειμένου να σχηματιστεί το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο. Έτσι η αδειοδότηση των θέσεων έναρξης της αντιγραφής θα συμβεί μια φορά ανά κυτταρικό κύκλο πράγμα το οποίο εξασφαλίζει την απρόσκοπτη αντιγραφή του γενετικού υλικού πριν την κυτταρική διαίρεση. Επίσης, το CDC6 συμμετέχει στα σημεία ελέγχου που ρυθμίζουν την φάση S του κυτταρικού κύκλου καθώς και την μίτωση. Όλο και περισσότερα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η απορρυθμισμένη έκφραση του CDC6 έχει ογκογόνο δυναμικό. Συγκεκριμένα, το CDC6 είναι συχνά υπερ-εκρφρασμένο από τα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης και συσχετίζεται με μειωμένο χρόνο ζωής των ασθενών. Επίσης, η υπερ-έκφραση του CDC6 έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε επαναντιγραφή του DNA και τελικά σε βλάβη του γενετικού υλικόυ και γενωμική αστάθεια. Η επακόλουθη ενεργοποίηση των κυτταρικών μηχανισμών απόκρισης στην βλάβη του DNA πυροδοτεί τους αντικαρκινικούς φραγμούς της κυτταρικής γήρανσης και της απόπτωσης, ενώ η απώλεια του ογκο-κατασταλτικού γονιδίου p53 προωθεί την ανάπτυξη κακοήθειας και τελικά την επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (EMT). Πιο πρόσφατα βρέθηκε ότι το CDC6 εμπλέκεται στην μεταγραφή του ριβοσωμικού RNA (rRNA). Προκειμένου να μελετήσουμε τον ρόλο του CDC6 στην ογκογένεση η ερευνητική μας ομάδα ανέπτυξε ένα κυτταρικό σύστημα το οποίο έχει την δυνατότητα να υπερ-εκφράζει τον παράγοντα CDC6 μέσα σε αθανατοποιημένα φυσιολογικά κύτταρα βρογχικού επιθηλίου (Human Bronchial Epithelial Cells, HBECs). Η αθανατοποίηση των κυττάρων έγινε με συνδυαστική υπερ-έκφραση τελομεράσης και της πρωτεΐνης CDK4. Τα κύτταρα αυτά διατηρούν τον επιθηλιακο τους φαινότυπο και έχουν άθικτο το μονοπάτι ελέγχου μέσω του p53. Έτσι, αντιπροσωπεύουν ένα φυσιολογικό επιθηλιακό περιβάλλον και αποτελούν ένα πολύτιμο εργαλείο για τη μελέτη της καρκινογένεσης, καθώς η πλειοψηφία των κακοηθειών έχει επιθηλιακή προέλευση και συγκεκριμένα ο καρκίνος του πνεύμονα βρίσκεται μεταξύ των πιο συχνών τύπων καρκίνου στον άνθρωπο.Η υπερ-έκφραση του CDC6 για 6 ημέρες είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κυτταρικής γήρανσης, ενώ η παρατεταμένη υπερ-έκφρασή του καθιστά τα κύτταρα ικανά να διαφύγουν της κυτταρικής γήρανσης μετά από περίπου 30 ημέρες. Παρόλα αυτά, τα γεγονότα που οδηγούν στην διαφυγή από την κυτταρική γήρανση δεν έιναι ξεκάθαρα. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι να μελετήσει τους μηχανισμούς που συμμετέχουν σε αυτή την διαδικασία.Σύντομα μετά την ενεργοποίηση του CDC6, εμφανίζονται βλάβες στο DNA και ως συνέπεια αυτού, οι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί του DNA ενεργοποιούνται. Όμως, τα μονοπάτια επιδιόρθωσης που ενεργοποιήθηκαν οδήγησαν στην εμφάνιση λαθών κατά την επιδιόρθωση του γενετικού υλικού. Έτσι, γενετικές αλλοιώσεις προέκυψαν και μεταξύ αυτών η πιο αξιοσημείωτη είναι μια εκτεταμένη αναστροφή του γενετικού υλικού στο χρωμόσωμα 3. Η περιοχή του χρωμοσώματος που αντιστρέφεται, περιλαμβάνει το γονίδιο BHLHE40. Η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από αυτό το γονίδιο είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας ο οποίος συμμετέχει στη ρύθμιση του κιρκάδιου ρυθμού. Σημαντικό κρίνεται το γεγονός ότι ο παράγοντας BHLHE40 ρυθμίζει >68% των γονιδίων που εμφανίζουν διαφορετική έκφραση ανάμεσα στα κύτταρα πριν και μετά την διαφυγή από την γήρανση. Επιπρόσθετα, ο παράγοντας BHLHE40 υπερ-εκφράζεται στα κύτταρα που διαφεύγουν από την κυτταρική γήρανση και επίσης παίζει κεντρικό ρόλο στην διατήρηση του φαινοτύπου τους. Για αυτό τον σκοπό, κατασκευάσαμε μια τεχνητή γενετική αναστροφή στο χρωμόσωμα 3, μιμούμενοι με αυτό τον τρόπο την αναστροφή που προέκυψε με φυσικό τρόπο. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα που φέρουν την αναστροφή διαφεύγουν από την κυτταρική γήρανση. Παρόμοια αποτελέσματα παρήχθησαν κατόπιν εισαγωγής στα HBECs του γονιδίου BHLHE40. Είναι επίσης πολύ ενδιαφέρον να τονισθεί ότι η αναδιαμόρφωση της τρισδιάστατης διαμόρφωσης της χρωματίνης στην περιοχή του γονιδίου BHLHE40 συμπίπτει με την ενεργοποίησή του.Τα προαναφερθέντα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι το CDC6 μπορεί να είναι ένας υποσχόμενος στόχος για την παρεμπόδιση της καρκινογένεσης. Δεδομένου ότι η υπερ-έκφραση του CDC6 συσχετίζεται επίσης με κακή πρόγνωση των ασθενών, βρήκαμε κυτταρικές σειρές μαστού που εκφράζουν σε περίσσεια τον εν λόγω παράγοντα και τον αποσιωπήσαμε. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, η αποσιώπηση του CDC6 προκαλεί βλάβες στο DNA και ενεργοποιεί την κυτταρική γήρανση και την απόπτωση. Σημαντικό κρίνεται το γεγονός ότι τα κύτταρα προερχόμενα από τριπλό αρνητικό καρκίνο μαστού πέθαναν μέσω μιτωτικής καταστροφής, πράγμα το οποίο συμπίπτει και με την κατάργηση του σημείου ελέγχου των G2/M φάσεων του κυτταρικού κύκλου.Συγκεντρωτικά, κατά την διάρκεια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, ανακαλύφθηκε ο μηχανισμός που βρίσκεται πίσω από την διαφυγή από την επαγόμενη από την ενεργοποίηση ογκογονιδίων κυτταρική γήρανση. Γεγονότα που συμβαίνουν τις πρώτες ημέρες μετά την ενεργοποίηση του CDC6 αποδείχθηκαν ότι παίζουν καθοριστικό ρόλο στην διαφυγή και συγκεκριμένα οι γενετικές αλλοιώσεις είναι ιδιαιτέρως σημαντικές στην εμφάνιση επιθετικών κυτταρικών κλώνων. Ανάμεσα τους μια αναστροφή στο χρωμόσωμα 3 οδήγησε στην αναδιαμόρφωση της τρισδιάστατης μορφής της χρωματίνης και επακόλουθα στην υπερ-έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα BHLHE40. Αυτό με την σειρά του τροποποίησε την έκφραση μιας σειράς γονίδιων και με αυτό τον τρόπο προωθήθηκε η διαφυγή από τον αντικαρκινικό φραγμό της κυτταρικής γήρανσης. Γνωρίζοντας πλέον ότι το CDC6 είναι το γεγονός που πυροδότησε τον κακοήθη φαινότυπο και επίσης συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση των ασθενών, η φαρμακευτική του αποσιώπηση θα μπορούσε να είναι μια έξυπνη προσέγγιση για την θεραπεία του καρκίνου.