Ταυτόχρονος προσδιορισμός βιομορίων με οπτικούς αισθητήρες

Abstract

Sepsis, a syndrome characterized by severe organ dysfunction, is caused by a dysregulated host immune response to infection and is one of the most common causes of morbidity and mortality worldwide. Early sepsis diagnosis is crucial for the timely initiation of an effective treatment in order to increase survival chances. This need for rapid and reliable diagnosis has led to introduction of various biomarkers whose the determination of concentration in the blood could contibute to sepsis diagnosis and/or prognosis. Towards the same direction, biosensors have been proposed as analytical tools for the determination of sepsis biomarkers since they can be incorporated to portable bioanalytical systems for determinations at the point of care. In this context, the aim of this doctoral thesis was to develop an optical immunosensor based on White Light Reflectance Spectroscopy (WLRS) for the simultaneous label-free determination of sepsis biomarkers. The targeted biomarkers were C-reactive protein (CRP), procalcitonin (PCT) and interleukin-6 (IL-6). The detection of these biomarkers is based on the real-time monitoring of the changes in interference spectrum created upon reflection of white light on a silicon/silicon dioxide chip where the specific antibody against each biomarker has been immobilized. Prior to immunosensor development, enzyme-linked immunosorbent assays were developed for each biomarker separately in order to evaluate the available immunoreagents and select the basic conditions of each assay. The immunoassays were then transferred to the optical biosensor, where the chemical and biological modification of chips were first studied and then the assay conditions for each biomarker were optimized. The method developed for CRP determination with the WLRS biosensor was rapid (12 min) and had a limit of detection (1 ng/mL) that allowed dilution of serum samples 20 to 1000 times to cover both the physiological (<5 μg/mL) and pathological CRP concentration range (>100 μg/mL). Regarding the determination of PCT and IL-6, the optimized assay protocols were similar allowing their simultaneous determination using silicon chips with two areas of different thickness of silicon dioxide. The limits of detection achieved were 2 and 0.01 ng/mL for PCT and IL-6, respectively, while the total analysis time was 35 min. Finally, a small-size automated bioanalytical device based on the WLRS biosensor was developed and evaluated for the determination of the three biomarkers at the point-of-care. To evaluate the immunoassays for CRP, PCT and IL-6 performed with the developed device serum samples were analysed and the concentrations detertmined were compared to those found on the same samples when analyzed by a certified clinical laboratory method. The results demonstrated a satisfactorily correlation of concentrations determined by the two methods. Thus, the immunochemical methods and the bioanalytical device developed are expected to facilitate the point-of-care determination of biomarkers related to sepsis diagnosis/prognosis and other pathological situations.

Η σήψη είναι ένα εξαιρετικά πολύπλοκο κλινικό σύνδρομο που εκδηλώνεται με δυσλειτουργία ζωτικών οργάνων ως αποτέλεσμα μη ρυθμισμένης ανοσολογικής απόκρισης του οργανισμού σε μία μικροβιακή λοίμωξη και αποτελεί μία από τις συχνότερες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως. Καθοριστικό ρόλο για την επιτυχημένη αντιμετώπιση περιστατικών σήψης είναι η έγκαιρη διάγνωσή τους έτσι ώστε να εφαρμοστεί στοχευμένη θεραπεία και να αυξηθούν τα ποσοστά επιβίωσης των ασθενών. Η ανάγκη αυτή έχει οδηγήσει στην καθιέρωση διαφόρων βιοδεικτών των οποίων ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης στο αίμα συμβάλλει τόσο για τη διάγνωση όσο και για την πρόγνωση της σήψης. Σε αυτήν την κατεύθυνση, οι βιοαισθητήρες προτείνονται ως αναλυτικό εργαλείο για τον προσδιορισμό των βιοδεικτών αυτών με απώτερο στόχο την ανάπτυξη αναλυτικών συστημάτων κατάλληλων για μετρήσεις στο σημείο φροντίδας του ασθενούς. Στα πλαίσια αυτά, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη οπτικoύ ανοσοαισθητήρα φασματοσκοπίας ανάκλασης λευκού φωτός (White Light Reflectance Spectroscopy, WLRS) για τον ταυτόχρονο ανοσοχημικό προσδιορισμό βιοδεικτών για τη διάγνωση της σήψης χωρίς τη χρήση ιχνηθετών. Οι τρεις βιοδείκτες-στόχοι ήταν η C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP), η προκαλσιτονίνη (PCT) και η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) και ο προσδιορισμός τους με τον βιοαισθητήρα βασίζεται στην ανίχνευση ανοσοαντιδράσεων σε πραγματικό χρόνο μέσω της παρακολούθησης της μετατόπισης του φάσματος συμβολής του φωτός που ανακλάται από επιφάνεια πυριτίου/διοξειδίου του πυριτίου στην οποία έχει ακινητοποιηθεί ειδικό αντίσωμα έναντι του κάθε βιοδείκτη.Αρχικά αναπτύχθηκαν για κάθε βιοδείκτη χωριστά ενζυμοανοσοχημικοί προσδιορισμοί σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης ώστε να αξιολoγηθούν τα διαθέσιμα αντιδραστήρια και να επιλεχθούν οι βασικές συνθήκες της ανάλυσης. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μεταφορά των ανοσοπροσδιορισμών στον οπτικό βιοαισθητήρα, όπου βελτιστοποιήθηκε η χημική και βιολογική τροποποίηση των επιφανειών καθώς και οι συνθήκες της ανάλυσης για κάθε βιοδείκτη. Ο ανοσοπροσδιορισμός που αναπτύχθηκε στον βιοαισθητήρα WLRS για την CRP ήταν ταχύς (12 min), με όριο ανίχνευσης (1 ng/mL) που επέτρεπε τον προσδιορισμό της σε ορό αίματος αραιωμένο 20 έως 1000 φορές. Όσον αφορά τον ανοσοπροσδιορισμό των PCT και IL-6, τα πρωτόκολλα ανάλυσης που υιοθετήθηκαν μετά τη βελτιστοποίηση ήταν όμοια και συνεπώς επέτρεπαν τον ταυτόχρονο προσδιορισμό τους χρησιμοποιώντας επιφάνειες πυριτίου με δύο περιοχές διοξειδίου του πυριτίου διαφορετικού πάχους. Τα όρια ανίχνευσης που επιτεύχθηκαν ήταν 2 ng/mL και 0.01 ng/mL για την PCT και την IL-6, αντίστοιχα, και η διάρκεια του ανοσοπροσδιορισμού 35 min. Τέλος, αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε μια ολοκληρωμένη μικρού μεγέθους αυτοματοποιημένη βιοαναλυτική συσκευή βασισμένη στον βιοαισθητήρα WLRS για τον προσδιορισμό των τριών βιοδεικτών στο σημείο φροντίδας του ασθενούς. Η αξιολόγηση των μεθόδων ανοσοπροσδιορισμού της CRP και ταυτόχρονου ανοπροσδιορισμού των PCT και IL-6 με την βιοαναλυτική συσκευή πραγματοποιήθηκε με μετρήσεις δειγμάτων ορού, τα οποία είχαν προηγουμένως αναλυθεί με πιστοποιημένη μέθοδο κλινικού εργαστηρίου και διαπιστώθηκε ικανοποιητική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που προσδιορίστηκαν με τις δύο μεθόδους. Επομένως οι αναπτυχθέντες ανοσοπροσδιορισμοί και η βιοαναλυτική συσκευή θα μπορούσαν να βρουν εφαρμογή στον επιτόπιο προσδιορισμό βιοδεικτών που σχετίζονται με τη διάγνωση/πρόγνωση της σήψης αλλά και άλλων παθολογικών καταστάσεων.