Περίληψη
Εισαγωγή: Τα μυοκαρδιακά κύτταρα έχουν την ιδιότητα να ανταποκρίνονται στα μηχανικά ερεθίσματα και να προσαρμόζουν ανάλογα τις βιολογικές λειτουργίες τους. Ειδικότερα, η κυτταρική σειρά καρδιομυοβλαστών H9C2 αποτελεί ένα πολύ συχνά χρησιμοποιούμενο in vitro μοντέλο, καθώς προσφέρει τη δυνατότητα μελέτης τόσο της διαδικασίας διαφοροποίησής τους προς έναν φαινότυπο παρόμοιο με αυτόν των ώριμων μυοκαρδιακών κυττάρων, όσο και διερεύνησης των αποκρίσεών τους υπό την επίδραση μηχανικής φόρτισης in vitro. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθούν κυτταρικά γεγονότα και μοριακά μονοπάτια που επισυμβαίνουν στους καρδιομυοβλάστες H9C2 κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησής τους και να εξεταστεί η επίδραση διαφορετικών πρωτοκόλλων μηχανικής φόρτισης των εν λόγω διαφοροποιημένων καρδιομυοβλαστών στην ενδοκυττάρια σηματοδότηση και στην έκφραση μυογεννετικών, αναβολικών, αποπτωτικών παραγόντων, καθώς και παραγόντων φλεγμονής και ατροφίας. Μέθοδοι: Καρδιομυοβλάστες H9C2 καλ-λιεργήθηκαν και διαφορ ...
Εισαγωγή: Τα μυοκαρδιακά κύτταρα έχουν την ιδιότητα να ανταποκρίνονται στα μηχανικά ερεθίσματα και να προσαρμόζουν ανάλογα τις βιολογικές λειτουργίες τους. Ειδικότερα, η κυτταρική σειρά καρδιομυοβλαστών H9C2 αποτελεί ένα πολύ συχνά χρησιμοποιούμενο in vitro μοντέλο, καθώς προσφέρει τη δυνατότητα μελέτης τόσο της διαδικασίας διαφοροποίησής τους προς έναν φαινότυπο παρόμοιο με αυτόν των ώριμων μυοκαρδιακών κυττάρων, όσο και διερεύνησης των αποκρίσεών τους υπό την επίδραση μηχανικής φόρτισης in vitro. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθούν κυτταρικά γεγονότα και μοριακά μονοπάτια που επισυμβαίνουν στους καρδιομυοβλάστες H9C2 κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησής τους και να εξεταστεί η επίδραση διαφορετικών πρωτοκόλλων μηχανικής φόρτισης των εν λόγω διαφοροποιημένων καρδιομυοβλαστών στην ενδοκυττάρια σηματοδότηση και στην έκφραση μυογεννετικών, αναβολικών, αποπτωτικών παραγόντων, καθώς και παραγόντων φλεγμονής και ατροφίας. Μέθοδοι: Καρδιομυοβλάστες H9C2 καλ-λιεργήθηκαν και διαφοροποιήθηκαν με σκοπό τον χαρακτηρισμό της διαφοροποίησης τους, ενώ αδιαφοροποίητοι καρδιομυοβλάστες H9C2 χρησιμοποιήθηκαν ως συνθήκη ελέγχου. Ακολούθως διαφοροποιημένοι καρδιομυοβλάστες H9C2 καλλιεργήθηκαν σε ελαστικές μεμβράνες και υποβλήθηκαν σε μηχανική φόρτιση χρησιμοποιώντας το σύστημα Flexcell Tension System. Κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε μηχανική φόρτιση χρησιμοποιήθηκαν ως συνθήκη ελέγχου. Για να εξεταστεί ο κυτταρικός κύκλος αδιαφοροποίητων καρδιομυοβλαστών H9C2 χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της κυτταρομετρίας ροής και ο ανοσοφθορισμός για την ανίχνευση της βαριάς αλυσίδας μυοσίνης και την μελέτη των δομικών αλλαγών που συμβαίνουν στους καρδιομυοβλάστες H9C2 κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησής τους. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκαν οι μεταβολές έκφρασης, σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης, που επισυμβαίνουν σε ειδικούς δείκτες καρδιακού φαινότυπου, σε παράγοντες ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, στους μυογενετικούς παράγοντες (MRFs), στις ισομορφές του IGF-1, σε παράγοντες ατροφίας, φλεγμονής, απόπτωσης καθώς και στην ενεργοποίηση των σηματοδοτικών πρωτεϊνών Akt, Erk 1/2 και p38. Για την επίδραση της μηχανικής φόρτισης σε διαφοροποιημένα μυοκαρδιακά κύτταρα H9C2 (5η ημέρα διαφοροποίησης), διερευνήθηκαν μεταβολές σε παράγοντες που συμβάλουν στην μυογένεση (MRFs), στις ισομορφές του IGF-1, σε παράγοντες ατροφίας, φλεγμονής, απόπτωσης και στην ενεργοποίηση των σηματοδοτικών πρωτεϊνων Akt και Erk 1/2. Για τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε one-way ANOVA. Αποτελέσματα: Συγκριτικά με τους αδιαφοροποίητους καρδιομυοβλάστες, τα διαφοροποιημένα μυοκαρδιακά κύτταρα H9C2 (5η ημέρα διαφοροποίησης) πα-ρουσιάζουν αύξηση της έκφρασης ειδικών δεικτών καρδιακού φαινότυπου και τελικής μυϊκής διαφοροποίησης, των μυογενετικών παραγόντων και των ισομορφών του IGF-1. Ακόμα, τα διαφοροποιημένα μυοκαρδιακά κύτταρα H9C2 μετά την επίδραση πρωτοκόλλου μηχανικής φόρτισης διάρκειας 12 ωρών παρουσίασαν αύξηση στην έκφραση των ισομορφών του IGF-1 και στην ενεργοποίηση των πρωτεϊνών Akt και Εrk 1/2, ενώ παρουσίασαν μείωση στην έκφραση των παραγόντων απόπτωσης, ατροφίας και φλεγμονής συγκριτικά τόσο με την συνθήκη ελέγχου (κύτταρα στα οποία δεν εφαρμόστηκε μηχανική φόρτιση) όσο και με κύτταρα στα οποία εφαρμόστηκαν πρωτόκολλα διάρκειας 15 λεπτών και 24 ωρών. Τα πρωτόκολλα μηχανικής φόρτισης μικρής συχνότητας (0.25 Hz) και επιμήκυνσης (2%) παρουσίασαν αύξηση στην έκφραση των μυογενετικών παραγόντων, των ισομορφών του IGF-1 και αύξηση την ενεργοποίηση της Akt και της Erk1/2, με ταυτόχρονη μείωση παραγόντων απόπτωσης, ατροφίας και φλεγμονής, συγκριτικά τόσο με τη συνθήκη ελέγχου (κύτταρα στα οποία δεν εφαρμόστηκε μηχανική φόρτιση) όσο και με κύτταρα στα οποία εφαρμόστηκαν πρωτόκολλα υψηλής συχνότητας (1Hz) και μεγάλης επιμήκυνσης (12%). Συμπεράσματα: Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης υποδηλώνουν ότι οι καρδιομυοβλάστες H9C2 εμφανίζουν φαινότυπο καρδιακής μυογένεσης κατά την 5η ημέρα διαφοροποίησής τους. Τα αποτελέσματα εφαρμογής πρωτοκόλλων μηχανικής φόρτισης σε διαφοροποιημένους καρδιομυοβλάστες H9C2 έδειξαν ότι ειδικότερα ένα πρωτόκολλο φόρτισης διάρκειας 12 ωρών μικρής συχνότητας (0.25 Ηz) και επιμήκυνσης (2%) προκαλεί τις πιο ευμενείς προσαρμογές στα εν λόγω μυοκαρδιακά κύτταρα.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Background: Cardiomyocytes possess the ability to respond to mechanical stimuli by adapting their biological functions. H9C2 cardiomyoblasts is a cell line used as an alternative for cardiomyocytes. They are used in vitro as a mimetic model for cardiac muscle due to their biochemical, morphological, and hormonal signalling properties. Thus, several studies have used H9C2 cells for examining their differentiation features towards a cardiac-like phenotype. This study investigated the adaptations of H9C2 cells during differentiation and the effects of different loading protocols on signalling and gene expression responses of myogenic, anabolic, inflammatory, atrophy and pro-apoptotic factors in differentiated cardiomyocyte-like H9C2 cells. Methods: H9C2 cardiomyoblasts cultured and differentiated in order to investigate differentiation process. Undifferentiated Η9C2 cardiomyoblasts used as control. Afterward, differentiated H9C2 cells were cultured on silicon elastic membranes and then un ...
Background: Cardiomyocytes possess the ability to respond to mechanical stimuli by adapting their biological functions. H9C2 cardiomyoblasts is a cell line used as an alternative for cardiomyocytes. They are used in vitro as a mimetic model for cardiac muscle due to their biochemical, morphological, and hormonal signalling properties. Thus, several studies have used H9C2 cells for examining their differentiation features towards a cardiac-like phenotype. This study investigated the adaptations of H9C2 cells during differentiation and the effects of different loading protocols on signalling and gene expression responses of myogenic, anabolic, inflammatory, atrophy and pro-apoptotic factors in differentiated cardiomyocyte-like H9C2 cells. Methods: H9C2 cardiomyoblasts cultured and differentiated in order to investigate differentiation process. Undifferentiated Η9C2 cardiomyoblasts used as control. Afterward, differentiated H9C2 cells were cultured on silicon elastic membranes and then underwent passive, cyclic mechanical stretch. Flow cytometry was used to characterize cell cycle of the H9C2 cardiomyoblasts and immunofluorescence to monitor structural changes during their differentiation. Moreover, alterations in the mRNA and protein expression levels of cardiac specific markers, as well as of cell cycle regulatory factors, myogenic regulatory factors (MRFs), IGF-1 isoforms, apoptotic, atrophy and inflammatory factors were evaluated during differentiation. p-Erk 1/2 and p-Akt, the myogenic factors MyoD and Myogenin and apoptotic factor p53 were determined by immunoblotting from stretched and non-stretched cardiomyocytes. qRT-PCR was used to measure changes in expression levels of the myogenic regulatory factors, growth, apoptotic, atrophy and inflammatory factors in response to mechanical loading of the H9C2 cells. Results: Compared to undifferentiated cells, differentiated cardiomyocyte-like H9C2 cells (5th day of differentiation) exhibited increased expression of cardiac specific markers, myosin heavy chain, MRFs, and IGF-1 isoforms. Moreover, cells that underwent a 12 hours duration mechanical stretch protocol increased expression of IGF-1 isoforms and decreased expression of apoptotic, atrophy and inflammatory factors, compared both to mechanical loading protocols with duration 24 hours and 15 minutes and to unloaded cells. Additionally, low frequency (0.25 Hz)/strain (2%) mechanical stretching protocol showed an enhanced expression of MRFs and IGF-1 isoforms along with a decreased expression of apoptotic, atrophy and inflammatory factors, compared both to high strain/frequency mechanical loading protocols and to unloaded cells. Conclusions: The findings of this study suggest that cardiomyoblast H9C2 exhibit a myogenic and cardiac differentiation at their 5th day of differentiation. Also, the effects of mechanical stretching on these differentiated cardiomyocyte-like cells suggest that a 12 hours duration, low frequency (0.25 Hz)/strain (2%) stretching protocol can be overall the most effective in inducing beneficial responses in these cardiomyotubes.
περισσότερα