Interleukin-33 and its contribution on innate immune mechanisms that mediate autoimmune manifestations of Systemic Lupus Erythematosus

Abstract

Systemic Lupus erythematosus (SLE) is the prototypic systemic autoimmune disease characterized by aberrant immune activation, defective clearance mechanisms, autoantibody formation, immune complexes accumulation and a profound type I IFN gene signature. One of the primary sources of IFN-α are plasmacytoid dendritic cells (pDCs) especially in response to Toll-like receptor(TLR)-7/9- and nucleic acid cytoplasmic sensors-mediated signaling. Additionally, transcriptomic and functional assays indicated that SLE neutrophils exhibit an over-activated status and enhanced capacity to form chromatin extracellular traps (NETs) which are considered key players in SLE pathogenesis. Pathogenic vicious feedback loops taking place in SLE can subsequently lead to end organ damage. Interleukin-33 (IL-33), a nuclear alarmin released mainly during necrotic cell death, exerts context-specific effects on adaptive and innate immune cells eliciting potent inflammatory or anti-inflammatory responses. The soluble regulatory receptor of IL-33, sST2, was monitored to display up-regulated levels in SLE patients’ sera and was correlated to disease severity and renal involvement. IL-33 is mainly expressed by non-hematopoietic cells of barrier tissues while recent findings suggest it is also released by immune cells upon inflammatory or damage/death-related stimuli. Until now, the role of neutrophil-derived IL-33 in autoimmunity has not been investigated. The main research questions addressed in this study are a) if SLE neutrophils exhibit differential expression levels of IL-33, b) If SLE-relevant stimuli promote the release of IL-33 decorated NETs, c) if SLE NETs display their inflammatory effects in an IL-33-dependent manner and, d) if IL-33 decorated NETs exhibit in vivo significance regarding SLE pathogenesis.Herein, we demonstrated that SLE neutrophils exhibit relatively increased IL-33 mRNA levels and the ability to release IL-33 decorated NETs both spontaneously and after IC-stimulation. IC-mediated NETs enhance IFN-α response by pDCs in a IL33R- (ST2L-) and IRF-7-dependent manner. IL33-silenced neutrophil-like cells cultured under lupus-inducing conditions generated NETs with diminished interferogenic effect. Notably, a focused proteomic analysis (PRM) and ex vivo functional aasays revealed that SLE patient-derived NETs are enriched in mature bioactive isoforms of IL-33 processed by the neutrophil proteases elastase and cathepsin G. Pharmacological inhibition of these proteases neutralized IL-33-dependent IFN-α production elicited by NETs. Regarding their in vivo significance in SLE, IL-33 decorated NETs were found up-regulated in SLE patients’ peripheral blood and were also detected at relevant inflamed tissues (kidneys, skin).To conclude, by using a combination of molecular, imaging and proteomic approaches, we revealed that SLE neutrophils -activated by disease immunocomplexes- release bioactive IL-33-bearing NETs exhibiting potent interferogenic capacity. These data support a novel role for cleaved IL-33 alarmin decorating NETs in human SLE, linking neutrophil activation, IFN-α production and end-organ inflammation.

Ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ) αποτελεί την πρωτότυπη συστηματική ασθένεια και χαρακτηρίζεται απο ανοσιακή ενεργοποίηση, ανεπάρκεια των μηχανισμών καθαρισμού της φλεγμονής, παραγωγή αυτοαντισωμάτων , σχηματισμό και συσσώρευση ανοσοσυμπλεγμάτων αλλά και απο την χαρακτηριστική γονιδιακή ‘’σφραγίδα’’ ιντερφερόνης-α. Μια από τις κύριες πηγές ιντερφερόνης-α είναι τα πλασματοκυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα μετά απο ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών των υποδοχέων τύπου Toll 7 και 9 ( TLR7/9) και των κυτταροπλασματικών υποδοχέων νουκλεικών οξέων. Πρόσφατες γονιδιακές και άλλες λειτουργικές μελέτες προτείνουν οτι τα ουδετερόφιλα ασθενών με ΣΕΛ χαρακτηρίζονται απο αυξημένη ενεργοποίηση και τάση να απελευθερώνουν εξωκυττάριες παγίδες χρωματίνης (NETs) αποτελώντας έτσι ρυθμιστές της παθογένειας της νόσου.Οι επιζήμιοι ανατροφοδοτικοί βρόχοι που λαμβάνουν χώρα στον ΣΕΛ οδηγούν συχνά σε ιστική βλάβη τελικού σταδίου.Η ιντερλευκίνη-33, μια πυρηνική πρωτείνη κινδύνου που απελευθερώνεται κατα την διάρκεια του νεκρωτικού κυτταρικού θανάτου, έχει ποικίλες επιδράσεις στα κύτταρα της επίκτητης και της φυσικής ανοσίας ανάλογα με το πλαίσιο στο οποίο μελετάται. Ο διαλυτός υποδοχέας της ΙL-33, sST2, έχει αυξημένα επίπεδα στον ορό ασθενών με ΣΕΛ που συσχετίζονται με την ενεργότητα της ασθένειας και με την εκδήλωση νεφρίτιδας. Η ιντερλευκίνη-33 εκφράζεται κυρίως απο κύτταρα της μη αιμοποιητικής σειράς των ιστών φραγμού αλλα πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν πως μπορεί και να εκκριθεί απο κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος αν ενεργοποιηθούν με φλεγμονώδη ερεθίσματα ή ερεθίσματα που σχετίζονται με βλάβη ή θάνατο. Μέχρι σήμερα, ο ρόλος της προερχόμενης απο ουδετερόφιλα IL-33 στην ανάπτυξη αυτοανοσιας δεν έχει ερευνηθεί. Τα κύρια ερευνητικά ερωτήματα που τίθενται σε αυτήν την έρευνα είναι: α) αν τα ΣΕΛ ουδετερόφιλα χαρακτηρίζονται απο σχετικά αυξημένη έκφραση της IL-33 β) αν διεγερτικά μόρια που σχετίζονται με τον ΣΕΛ μπορούν να προκαλέσουν απελευθέρωση εξωκυττάριων παγίδων ουδετεροφίλων (ΝΕΤs) διακοσμημένων με IL-33 γ) αν τα ΣΕΛ ΝΕΤs παρουσιάζουν φλεγμονώδεις επιδράσεις που εξαρτώνται απο την IL-33 δ) αν τα ΝΕΤs που διακοσμούνται με IL-33 έχουν κάποια in vivo σημασία που σχετίζεται με την παθογένεια του ΣΕΛ.Σε αυτήν την έρευνα, αποδείξαμε ότι τα ΣΕΛ ουδετερόφιλα παρουσιάζουν συγκριτικά αυξημένα επίπεδα IL-33 mRNA και έχουν την ικανότητα να απελευθερώνουν εξωκυττάριες παγίδες διακοσμημένες με IL-33 αυθόρμητα ή μετά απο ενεργοποίηση με χρήση ανοσοσυμπλεγμάτων. Οι επαγόμενες απο ανοσοσυμπλέγματα- εξωκυττάριες παγίδες επάγουν την παραγωγή ιντερφερόνης-α (IFN-α) απο τα πλασματοκυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα (pDCs) μέσω του υποδοχέα της IL-33 (ST2L) ενεργοποιώντας τον μεταγραφικό παράγοντα IRF-7. Οταν αποσιωπήθηκε το γονίδιο της IL-33 σε κυτταρική σειρά που προσομοιάζει τα ουδετερόφιλα κάτω απο συνθήκες πάρομοιες με αυτές που υπάρχουν στο περιβάλλον του ΣΕΛ, οι εξωκυττάριες παγίδες που δημιουργήθηκαν είχαν μειωμένη ικανότητα να προάγουν την έκκριση IFN-α. Μια στοχευμένη πρωτεομική μελέτη (PRM) και ex vivo λειτουργικά πειράματα αποκάλυψαν οτι στις εξωκυττάριες παγίδες των ασθενών με ΣΕΛ εντοπίζονται βιοενεργές ισομορφές της IL-33 που προέρχονται απο την επεξεργασία μέσω πρωτεασών των ουδετεροφίλων, όπως είναι η ελαστάση και η καθεψίνη G. Φαρμακευτική αναστολή αυτών των πρωτεασών εξουδετέρωσαν την επαγόμενη απο IL-33 παραγωγή IFN-α που προκαλείται μέσω των NETs. Όσον αφορά την in vivo σημασία τους στον ΣΕΛ, εξωκυττάριες παγίδες διακοσμημένες με IL-33 παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα στο περιφερικό αίμα ασθενών ΣΕΛ ενω εντοπίστηκαν και σε χαρακτηριστικούς φλεγμαίνοντες ιστούς (νεφροί,δέρμα).Συνοψίζοντας, επιστρατεύοντας εναν συνδυασμό απο μοριακές ,απεικονιστικές και πρωτεομικές προσεγγίσεις αποκαλύψαμε ότι τα ΣΕΛ ουδετερόφιλα – όταν ενεργοποιούνται με ανοσοσυμπλέγματα σχετιζόμενα με την ασθένεια- απελευθερώνουν εξωκυττάριες παγίδες που φέρουν βιοδραστική IL-33 και διακρίνονται απο την ικανότητα τους να επάγουν την παραγωγή IFN-α. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ένα σημαντικό ρόλο για την βιοδραστικη πρωτείνη κινδύνου IL-33 που διακοσμεί τα ΝΕΤs των ανθρώπων με ΣΕΛ, συνδέοντας την ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων , την παραγωγή IFN-α και την τελικού σταδίου ιστική φλεγμονή.