Studies on the biochemistry of the targeting domain of lysostaphin

Abstract

Lysostaphin from S. simulans was cloned in expression vector pET21a and expressed and purified in E .coli. A spot test and a broth dilution assay indicated that the minimum inhibitory concentration of lysostaphin required to kill EMRSA-16 was 40 nM. Lysostaphin consists of an endopeptidase and a trargeting domain the former of which codes for catalytic activity while the latter is responsible for substrate specificity. In order to find out whether the targeting domain of lysostaphin is an individually functional domain, it was cloned in vector pET21d and expressed in E. coli. The purified protein was assayed against EMRSA-16 in the presence of mature lysostaphin and it was found that the targeting domain alone can protect EMRSA-16 cells. This further indicated the potential of the targeting domain of lysostaphin to be used in future domain swapping studies with other proteins. Random PCR mutagenesis was used to identify putative active site residues in the C-terminal targeting domain of lysostaphin. One mutation was isolated, where a phenylalanine was replaced by a serine at position 172 of the mature protein. Sequence alignment with other lysostaphin homologues indicated the presence of three more conserved amino acids, two tyrosines at positions 203 and 226 and a tryptophan at position 214. Site-directed mutagenesis was employed to mutate all conserved residues to alanine and FI 72 to tyrosine to distinguish between important from unimportant sites. All six mutants (F172S, F172A, F172Y, Y203A, Y226A and W214A) were cloned and their proteins expressed and purified in E. coli. Their activity was assayed in an agar diffusion assay, a broth dilution assay, turbidimetrically and in a FRET assay. The results indicated that mutants F172S, F172Y, Y203A and Y226A remained bacteriolytic while mutants F172A and W214A had lost most of their activity, suggesting their significance in the activity of lysostaphin. Finally, a reversion experiment carried out with FI72A confirmed the importance of phenylalanine at position 172 of the mature protein.

Λυσοσταφίνη από το βακτήριο S. simulans κλωνοποιήθηκε στον φορέα έκφρασης pET21a και εκφράστηκε και καθαρίστηκε μέσω του βακτηρίου E.coli. Κάνοντας χρήση της μεθόδου διάχυσης σε άγαρ με δοκιμή κηλίδας και της μεθόδου αραίωσης σε ζωμό βρέθηκε ότι η ελάχιστη ανασταλτική πυκνότητα της λυσοσταφίνης που απαιτείται για να λύσει το μικρόβιο EMRSA ήταν 40nM. Η λυσοσταφίνη αποτελείται από έναν ενδοπεπτιδικό τομέα και έναν τομέα στόχευσης. Ο πρώτος ευθύνεται για την κωδικοποίηση της καταλυτικής δράσης της λυσοσταφίνης ενώ ο δεύτερος καθορίζει την εξειδίκευση του υποστρώματος. Προκειμένου να ανακαλύψουμε αν ο τομέας στόχευσης της λυσοσταφίνης είναι ένας αυτόνομος λειτουργικά τομέας, τον κλωνοποιήσαμε στον φορέα έκφρασης pET21d και τον εκφράσαμε μέσω του βακτηρίου E. coli. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη δοκιμάστηκε με τον EMRSA-16 παρουσία ώριμης λυσοσταφίνης και βρέθηκε ότι ο τομέας στόχευσης από μόνος του μπορεί να προστατεύσει το βακτήριο EMRSA-16. Επιπλέον, το αποτέλεσμα αυτό μας υπέδειξε την δυνατότητα του τομέα στόχευσης της λυσοσταφίνης να χρησιμοποιηθεί σε μελλοντικές μελέτες ανταλλαγής τομέων με άλλες πρωτεΐνες. Η μέθοδος της τυχαίας μεταλλαξιογένεσης μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση πιθανών καταλοίπων ενεργών θέσεων στο C-τερματικό του τομέα στόχευσης της λυσοσταφίνης. Απομονώσαμε μία μετάλλαξη η οποία αφορά στην αντικατάσταση της φαινυλαλανίνης από σερίνη στην θέση 172 της ώριμης πρωτεΐνης. Ευθυγράμμιση αλληλουχίας με άλλα ομόλογα της λυσοσταφίνης υπέδειξαν την παρουσία τριών ακόμα διατηρημένων αμινοξέων, δύο τυροσινών στις θέσεις 203 και 226 και μίας τρυπτοφάνης στην θέση 214. Η μέθοδος της κατευθυνόμενης μεταλλαξιογένεσης χρησιμοποιήθηκε για να μεταλλάξει όλα τα διατηρημένα αμινοξέα σε αλανίνη και το αμινοξύ της θέσης F172 σε τυροσίνη ώστε να διακρίνουμε μεταξύ σημαντικών και μη σημαντικών θέσεων. Και οι έξι μεταλλάξεις (F172S, F172A, F172Y, Y203A, Y226A και W214A) κλωνοποιήθηκαν και οι πρωτεΐνες τους εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν μέσω του βακτηρίου E.coli. Η βακτηριολυτική τους δράση δοκιμάστηκε μέσω της μεθόδου διάχυσης σε άγαρ, της μεθόδου διάλυσης σε ζωμό και μέσω της τεχνικής μεταφοράς ενέργειας φθορισμού με αντήχηση (FRET-assay). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πρωτεΐνες με τις μεταλλάξεις F172S, F172Y, Y203A και Y226A παρέμειναν ενεργές ενώ οι πρωτεΐνες με τις μεταλλάξεις F172A και W214A είχαν χάσει όλη την βακτηριολυτική τους ικανότητα, υποδηλώνοντας την σημασία τους στην δράση της λυσοσταφίνης. Τέλος, διεξήχθη πείραμα επαναφοράς με την μετάλλαξη F172A επιβεβαιώνοντας την σημασία της φαινιλαλανίνης στην θέση 172 της ώριμης πρωτεΐνης.