Σχεδιασμός, σύνθεση και μελέτη ενώσεων με συνδυασμένη δράση για την αντιμετώπιση καταστάσεων οι οποίες εμπλέκουν φλεγμονή

Abstract

In the present doctorate thesis new derivatives of the classical non steroidal anti-inflammatory drugs (NSAID) were synthsised, isolated, identified and their biological activity was evaluated as novel anti-inflammatory agents. There is still a need for novel anti-inflammatory drugs due to the ceiling effect of the existing. The selected NSAID were ibuprofen, naproxen and ketoprofen, known and widely used drugs. First, their acidic character was reduced by amidation of the free carboxylic group. This modification is expected to decrease the local irritation of the acids to the gastrointestinal system. The amino acids beta-alanine, L-proline and L-tyrosine were selected for amidation. The carboxylic group of the classical NSAID is responsible for the observed inhibition of oxidative phosphorylation, thus adenine triphosphate (ATP) synthesis is reduced. As a result, there is a loss of the tight junction of epithelial cells, and a rise in their permeability. Furthermore, the inhibition of oxidative phosphorylation may cause reactive oxygen species (ROS) generation. Since the known NSAID inhibit both cyclooxygenase (COX) isoforms, the synthesis of the gastroprotective prostaglandins via COX-1 is inhibited. NSAID influence gastric circulation by reducing blood flow, due to vasodialory prostaglandins (E and I) inhibition. Because of the low blood flow in the stomach, pH is further reduced, permitting acid diffusion deeper in the mucosa, causing necrosis and hemorrhage. The mucous becomes thinner, bicarbonate production, blood flow, epithelial cell proliferation and epithelial resistance to injury are reduced. Increase of the molecular volume of the new compounds could support their anti-inflammatory activity. The proteins of COX isoforms are similar; however, COX-2 has a larger binding area than COX-1. Therefore, in one group of compounds the amino acid carboxylate was esterified with the bioactive 3,4,5-trimethoxybenzyl alcohol. Two more compounds were synthesised starting with the inactive indole-3-acetic acid. The compounds of the second group were esters of cinnamyl alcohol, which has been found to inhibit lipoxygenase (LOX), contributing to anti-inflammatory activity. The compounds of the third group were nitric esters, able to libarate nitrogen monoxide (NO), which inhibits inflammatory reaction. Low concentrations of ΝΟ activate cyclooxygenase, after the reaction with superoxide anion radical. High concentration of NO, by reducing ferric ions, results in enzyme inhibition. Furthermore, peroxynitrite inhibits cyclooxygenase irreversibly. Nitric oxide also inhibits lipoxygenase (LOX), which catalyses leukotriene production from arachidonic acid. The in vitro ability of the new compounds to inhibit inflammation enzymes (COX-1, COX-2, LOX) was determined. Nitric esters were further tested for their ability to liberate NO. The in vivo effect of the new compounds on acute inflammation was examined, determining the reduction of paw oedema after carrageenan administration to rats. Preliminary experiments were performed to investigate the stability of representative compounds in the presence of water and plasma. It was found that the new compounds have significant anti-inflammatory activity and that they inhibit inflammation enzymes to varying degrees. Studies of docking of selected compounds to the active sites of COX-1 and COX-2 contribute to the elucidation of their interaction with these enzymes.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή συντέθηκαν, απομονώθηκαν, ταυτοποιήθηκαν και αξιολογήθηκαν ως προς τη βιολογική δράση τους νέα παράγωγα κλασσικών μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (ΜΣΑΦ) ως νέα αντιφλεγμονώδη. Η ανάγκη για την σύνθεση καινούριων αυξάνεται συνεχώς καθώς έχει σημειωθεί το φαινόμενο οροφής. Ως ΜΣΑΦ επιλέχθηκαν η ιβουπροφαίνη, η ναπροξένη και η κετοπροφαίνη, πολύ γνωστά και ευρέως χρησιμοποιούμενα φάρμακα. Αρχικά, ο όξινος χαρακτήρας αυτών μειώθηκε με αμιδοποίηση. Η τροποποίηση αυτή αναμένεται να μειώσει την τοπική ερεθιστική δράση των οξέων στο γαστρεντερικό. Για το σκοπό αυτό, επελέγησαν τα αμινοξέα β-αλανίνη, L-προλίνη και L-τυροσίνη. Καθώς η ύπαρξη της καρβοξυλικής ομάδας που περιέχουν τα κλασσικά NSAID οδηγεί σε αναστολή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, μειώνεται η σύνθεση της τριφωσφορική αδενοσίνης (ATP). Αποτέλεσμα είναι η απώλεια της ερμητικής σύνδεσης των κυττάρων της επιθηλιακής στιβάδας επομένως η αύξηση της διαπερατότητας αυτής. Επί πλέον, η αναστολή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης είναι υπεύθυνη για την απελευθέρωση δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Επειδή τα γνωστά ΜΣΑΦ αναστέλλουν και τις δύο ισομορφές της κυκλοξυγονάσης (COX), με την αναστολή της COX-1 μειώνεται η σύνθεση των προστατευτικών για το στόμαχο προσταγλανδινών. Τα ΜΣΑΦ επηρεάζουν την γαστρική κυκλοφορία μειώνοντας την γαστρική ροή, λόγω της αναστολής των αγγειοδιασταλτικών προσταγλανδινών (Ε και Ι). Εξαιτίας της μειωμένης ροής αίματος στον στόμαχο, το pH χαμηλώνει περισσότερο και επιτρέπει την διάχυση οξέων ακόμα βαθύτερα στον βλεννογόνο, προκαλώντας έτσι νέκρωση και αιμορραγία. Επέρχεται μείωση του πάχους της βλεννογόνου στιβάδας, μείωση της έκκρισης διττανθρακικών, της ροής του αίματος, του πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών κυττάρων, καθώς και της αντίστασης του επιθηλίου σε τραυματισμό. Αύξηση του μοριακού όγκου των νέων ενώσεων θα μπορούσε να ενισχύσει την αντιφλεγμονώδη δράση. Οι πρωτεΐνες των δυο ισομορφών COX διαφέρουν πολύ λίγο μεταξύ τους. Παρόλα αυτά η COX-2 διαθέτει μεγαλύτερη περιοχή σύνδεσης από την COX-1. Έτσι, σε μια ομάδα η καρβοξυλική ομάδα των αμινοξέων εστεροποιείται με την βιοδραστική αλκοόλη 3,4,5-τριμεθοξυβενζυλική. Συντέθηκαν επίσης δυο ενώσεις ελέγχου που υπέστησαν τις ίδιες τροποποιήσεις ξεκινώντας όμως από το αδρανές ινδολοξικό οξύ. Σε μια δεύτερη ομάδα η εστεροποίηση έγινε με την κινναμωμική αλκόολη, η οποία έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την λιποξυγονάση, συμβάλλοντας στην αντιφλεγμονώδη δράση. Στην τρίτη ομάδα δημιουργήθηκαν παράγωγα ικανά να απελευθερώνουν μονοξείδιο του αζώτου, καθώς η παρουσία του μονοξειδίου του αζώτου δρα ανασταλτικά επί της φλεγμονώδους διαδικασίας. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις, το ΝΟ, αντιδρώντας με τη ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου, ενεργοποιεί την κυκλοξυγονάση. Σε υψηλές συγκεντρώσεις ΝΟ, αυτό αλληλεπιδρά με τον τρισθενή σίδηρο και δρα ως αναστολέας του ενζύμου. Επιπροσθέτως, το σχηματιζόμενο υπεροξυνιτρώδες επίσης αναστέλλει μη αντιστρεπτά την κυκλοξυγονάση. Το μονοξείδιο του αζώτου αναστέλλει και τη λιποξυγονάση (LOX), η οποία καταλύει τη μετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε λευκοτριένια. In vitro προσδιορίστηκε η ικανότητα των νέων ενώσεων να αναστέλλουν τα ένζυμα της φλεγμονής (COX-1, COX-2, LOX). Για τις ενώσεις που είναι νιτρικοί εστέρες προσδιορίστηκε η ικανότητα απελευθέρωσης ΝΟ. In vivo ελέγχθηκε η δράση τους επί της οξείας φλεγμονής, με προσδιορισμό της ικανότητας αναστολής οιδήματος προκαλούμενου από καραγεννίνη σε επίμυες. Έγιναν προκαταρκτικά πειράματα ελέγχου της σταθερότητας αντιπροσωπευτικών ενώσεων παρουσία νερού και πλάσματος. Μελέτες πρόσδεσης επιλεγμένων ενώσεων στα ενεργά κέντρα των COX-1 και COX-2 συντελούν στην διερεύνηση της αλληλεπίδρασης με το ένζυμο.