Study of confectionery industry waste valorization for microbial oil production via fermentation using oleaginous yeasts

Abstract

This doctoral dissertation focused on the valorisation of renewable resources generated bythe food industry for the biotechnological production of microbial oil. Microbial oil has beenevaluated as potential feedstock for the production of biodiesel.The first part of this PhD thesis demonstrated that flour-rich waste (FRW) and by-productstreams generated by bakery, confectionery and wheat milling plants could be employed asthe sole raw materials for generic fermentation media production, suitable for microbial oilsynthesis. Wheat milling by-products were used in solid state fermentations (SSF) ofAspergillus awamori for the production of crude enzymes, mainly glucoamylase andprotease. Enzyme-rich SSF solids were subsequently employed for hydrolysis of FRWstreams into nutrient-rich fermentation media. Batch hydrolytic experiments using FRWconcentrations up to 205 g/L resulted in higher than 90% (w/w) starch to glucose conversionyields and 40% (w/w) total Kjeldahl nitrogen to free amino nitrogen conversion yields.Starch to glucose conversion yields of 98.2, 86.1 and 73.4% (w/w) were achieved wheninitial FRW concentrations of 235, 300 and 350 g/L were employed in fed-batch hydrolyticexperiments, respectively. Crude hydrolysates were used as fermentation media in shakeflask cultures with the oleaginous yeast Lipomyces starkeyi DSM 70296 reaching a total dryweight of 30.5 g/L with a microbial oil content of 40.4% (w/w), higher than that achievedin synthetic media. Fed-batch bioreactor cultures led to a total dry weight of 109.8 g/L witha microbial oil content of 57.8% (w/w) and productivity of 0.4 g/(L⸱h).This PhD thesis subsequently dealt with the production of crude enzymes via SSF usingwheat milling by-products for both fermentation media production using FRW streams andlysis of Rhodosporidium toruloides yeast cells. Filter sterilization of crude hydrolysates wasmore beneficial than heat sterilization regarding yeast growth and microbial oil production.The initial carbon to free amino nitrogen ratio of crude hydrolysates was optimized (80.2g/g) in fed-batch cultures of R. toruloides leading to a total dry weight of 61.2 g/L withmicrobial oil content of 61.8 % (w/w). A feeding strategy where the glucose concentrationwas maintained in the range of 12.2 – 17.6 g/L led to the highest productivity (0.32 g/L∙h).ivThe crude enzymes produced by SSF were utilised for yeast cell treatment leading tosimultaneous release of around 80% of total lipids in the broth and production of ahydrolysate suitable as yeast extract replacement.The next part of the thesis was related to the utilization of diversified mixed confectionerywaste streams in a two-stage bioprocess to formulate nutrient-rich fermentation media formicrobial oil production. Solid state fermentation was conducted for the production of crudeenzyme consortia to be subsequently applied in hydrolytic reactions to break down starch,disaccharides and proteins into monosaccharides, amino acids and peptides. Crudehydrolysates were evaluated in bioconversion processes using R. toruloides DSM 4444 inboth batch and fed-batch mode. Under nitrogen-limiting conditions, during fed-batchcultures, the concentration of microbial lipids reached 16.6 – 17.0 g/L with the intracellularcontent being more than 40% (w/w) in both hydrolysates applied. R. toruloides was able tometabolize mixed carbon sources without catabolite repression. The fatty acid profile of theproduced lipids was altered based on the substrate employed in the bioconversion process.Microbial lipids were rich in unsaturated fatty acids, with oleic acid being the major fattyacid (61.7%, w/w).This PhD thesis finally focused on the evaluation of biodiesel production using microbialoil derived from FRW hydrolysates. Crude hydrolyzates were used in fed-batch bioreactorfermentations at a C/FAN ratio of 80.2 g/g with the oleaginous yeast R. toruloides. Microbialoil was transesterified into biodiesel with satisfactory performance considering the Europeanstandard EN 14214. This work demonstrated that valorization of food waste for biodieselproduction could be feasible.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην αξιοποίηση ανανεώσιμων πρώτωνυλών, που προέρχονται από υποπροϊόντα βιομηχανιών τροφίμων για τη βιοτεχνολογικήπαραγωγή μικροβιακού λίπους. Εξετάστηκε η πιθανή χρήση του παραγόμενου μικροβιακούλίπους ως πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοντίζελ.Το πρώτο μέρος της διατριβής έδειξε ότι τα αλευρούχα υπολείμματα (flour-rich-waste-FRW) και τα ρεύματα υποπροϊόντων που προέρχονται από μονάδες αρτοποιίας,ζαχαροπλαστικής και αλέσεως σίτου μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πλήρεις πρώτες ύλεςγια την παραγωγή θρεπτικών μέσων ζύμωσης, κατάλληλες για τη σύνθεση μικροβιακώνλιπιδίων. Τα παραπροϊόντα άλεσης σίτου χρησιμοποιήθηκαν σε ζυμώσεις στερεάςκατάστασης (solid state fermentation-SSF) με το στέλεχος Aspergillus awamori για τηνπαραγωγή ακατέργαστων ενζύμων, κυρίως γλυκοαμυλάση και πρωτεάση. Τα πλούσια σεένζυμα στερεά χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για την υδρόλυση των FRW προςπαραγωγή πλούσιων σε θρεπτικά μέσων ζύμωσης. Οι κλειστού τύπου υδρολύσεις, με τηνχρήση αρχικών συγκεντρώσεων FRW έως και 205 g/L είχαν ως αποτέλεσμα αποδόσειςμετατροπής αμύλου σε γλυκόζη υψηλότερες από 90% (w/w) και σε 40% (w/w) απόδοσημετατροπής ολικού αζώτου (Kjeldahl) προς ελεύθερες αμινομάδες αμινοξέων και πεπτιδίων(free amino nitrogen-FAN). Αποδόσεις μετατροπής αμύλου σε γλυκόζη ίσες με 98,2%,86,1% και 73,4% (w/w), επιτεύχθηκαν σε αντίστοιχες αρχικές συγκεντρώσεις FRW 235g/L, 300 g/L και 350 g/L μέσω ενζυμικών υδρολύσεων ημισυνεχούς λειτουργίας. Ενσυνεχεία, τα υδρολύματα που προέκυψαν από τις ενζυμικές υδρολύσεις των FRWχρησιμοποιήθηκαν ως θρεπτικό υπόστρωμα ζύμωσης προς παραγωγή μικροβιακού λίπουςμε την ζύμη Lipomyces starkeyi DSM 70296. Η παραγωγή μικροβιακής βιομάζας (total dryweight-TDW) που επιτεύχθηκε ήταν 30,5 g/L με λιποπεριεκτικότητα 40,4% (w/w), τιμέςυψηλότερες από τις αντίστοιχες που προέκυψαν με την χρήση συνθετικών θρεπτικώνμέσων. Οι ζυμώσεις ημισυνεχούς καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα οδήγησαν σε TDW109,8 g/L με λιποπεριεκτικότητα 57,8% (w/w) και παραγωγικότητα 0,4 g/(L⸱h).Το επόμενο μέρος της διδακτορικής διατριβής αφορούσε στην παραγωγή ακατέργαστωνενζύμων μέσω SSF χρησιμοποιώντας παραπροϊόντα άλεσης σίτου τόσο για την παραγωγήθρεπτικών μέσων ζύμωσης αξιοποιώντας FRW, όσο και για τη λύση των κυττάρων ζύμηςτου στελέχους Rhodosporidium toruloides. Η αποστείρωση με φίλτρο των ακατέργαστωνπαραγόμενων υδρολυμάτων ήταν ευεργετικότερη σε σύγκριση με την θερμικήαποστείρωση όσον αφορά στην ανάπτυξη ζύμης και στην παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων.Η αρχική αναλογία άνθρακα προς FAN των ακατέργαστων υδρολυμάτων βελτιστοποιήθηκε(80,2 g/g) σε ζυμώσεις ημισυνεχούς καλλιέργειας του R. toruloides, οδηγώντας σε TDW61,2 g/L με λιποπεριεκτικότητα 61,8% (w/w). Με την εφαρμογή μιας στρατηγικήτροφοδοσίας κατά την οποία η συγκέντρωση γλυκόζης διατηρήθηκε σε εύρος 12,2 - 17,6g/L επιτεύχθηκε η υψηλότερη τιμή παραγωγικότητας (0,32 g/(L⸱h)). Τα ακατέργασταένζυμα που παράχθηκαν μέσω SSF χρησιμοποιήθηκαν για την επεξεργασία των κυττάρωντης ζύμης οδηγώντας σε ταυτόχρονη απελευθέρωση περίπου 80% των συνολικών λιπιδίωνστο υγρό της ζύμωσης και σε παραγωγή ενός υδρολύματος ως υποκατάστατο εκχυλίσματοςζύμης.Το επόμενο στάδιο της εργασίας αφορούσε την αξιοποίηση μικτών παραπροϊόντωνζαχαροπλαστικής σε βιοδιεργασία δύο σταδίων προς παραγωγή ενός πλούσιου σε θρεπτικάσυστατικά μέσου ζύμωσης κατάλληλου για την παραγωγή μικροβιακού λίπους. Αρχικάδιεξήχθη ζύμωση στερεής κατάστασης για την παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων που στηνσυνέχεια χρησιμοποιήθηκαν σε υδρολυτικές αντιδράσεις για την διάσπαση του αμύλου,δισακχαριτών και πρωτεϊνών σε μονοσακχαρίτες, αμινοξέα και πεπτίδια. Τα παραγόμεναυδρολύματα αξιολογήθηκαν σε διεργασίες βιομετατροπής με την χρήση της ζύμης R.toruloides DSM 4444 σε ζυμώσεις κλειστής καλλιέργειας και ημισυνεχούς καλλιέργειας.Υπό συνθήκες περιορισμού του αζώτου, κατά τη διάρκεια ημισυνεχών ζυμώσεων, ησυγκέντρωση των μικροβιακών λιπιδίων κυμάνθηκε από 16,6 έως 17,0 g/L με τοενδοκυτταρικό περιεχόμενο να είναι μεγαλύτερο του 40% (w/w). Το στέλεχος της ζύμηςήταν ικανό να μεταβολίζει τις μικτές πηγές άνθρακα χωρίς καταστολή του καταβολισμού.Το προφίλ λιπαρών οξέων των παραγόμενων λιπιδίων μεταβλήθηκε με βάση το υπόστρωμαπου χρησιμοποιήθηκε στη διαδικασία βιομετατροπής. Τα μικροβιακά λιπίδια ήταν πλούσιασε ακόρεστα λιπαρά οξέα, με το ελαϊκό οξύ να είναι το κύριο λιπαρό οξύ (61,7%, w/w).Το τελευταίο μέρος αυτής της διπλωματικής εργασίας περιελάμβανε την αξιολόγηση τηςπαραγωγής βιοντίζελ χρησιμοποιώντας μικροβιακό λίπος που προέρχεται από υδρολύματαFRW. Χρησιμοποιήθηκαν ακατέργαστα υδρολύματα σε ζυμώσεις βιοαντιδραστήρωνημισυνεχούς λειτουργίας σε αναλογία C/FAN 80,2 g/g με το στέλεχος ζύμης R. toruloides.Το μικροβιακό λίπος μετεστεροποιήθηκε σε βιοντίζελ με ικανοποιητικές επιδόσειςλαμβάνοντας υπόψη το ευρωπαϊκό πρότυπο EN 14214. Αυτή η εργασία έδειξε ότι ηαξιοποίηση των απορριμμάτων τροφίμων για την παραγωγή βιοντίζελ μπορεί να είναιεφικτή.