Investigating mechanisms of T Cell recruitment to sites of inflammation and injury: the novel roles of endothelial Cell STING ant T Cell CD43

Abstract

The leukocyte recruitment cascade is a well-orchestrated series of events leading to inflammatory cells crossing the vascular wall and reaching peripheral tissues. Therefore, understanding how surface molecules on leukocytes react to signaling queues by the vascular endothelium is of paramount importance. In the present thesis work, I examined the roles of the T cell transmembrane molecule CD43 and the endothelial cell intracellular molecule STING in the leukocyte recruitment and in inflammatory processes. Sialomucin CD43 is a transmembrane glycoprotein functioning as an E-Selectin ligand for Th17 cells in vitro that is required for rolling on the vascular endothelium and Th17 Cell recruitment during inflammation in vivo. In this thesis I investigated how CD43 regulates the Th17 cell steps required for leukocyte recruitment. I found that CD43 promotes Th17 cell intercellular adhesion molecule 1-dependent adhesion, apical migration and transendothelial migration (TEM). STING senses cyclic di-nucleotides released in response to double stranded DNA, and functions as an adaptor molecule for type I interferon (IFN-I) signaling by activating IFN-I stimulated genes (ISG). I investigated the roles of STING in T cell recruitment in response to acute peritonitis, cardiac pressure-overload induced inflammatory responses as well as in the context of vascular injury. I found that T cell infiltration into the peritoneum in response to TNF-α is highly dependent on STING expression on endothelial cells, using global and inducible EC-specific STING-/- mice, a tool I generated during my thesis. T cell transendothelial migration (TEM) across mouse and human EC deficient in STING was strikingly reduced compared to control EC, whereas T cells adhesion was not impaired. I additionally found that T cell STING does not contribute to T cell TEM. Mechanistically, I identified the EC IFN-I-IFNAR axis as a critical signaling cascade in response to TNF-α—induced T cell recruitment and pinpointed CXCL10, an ISG and a chemoattractant for T cells, as a key player in the process. Because Th1 recruitment is a critical step for cardiac inflammation and maladaptive cardiac remodeling in response to pressure overload induced heart failure, I investigated whether STING contributed to this process in heart failure. I showed that STING-/- mice exhibited reduced cardiac fibrosis and left ventricular hypertrophy and that correlated with reduced hallmarks of HF. My findings point to a role of STING in cardiac inflammation and open an avenue to investigate the specific role of endothelial STING in this model. I also hypothesized that EC STING modulates other aspects of EC responses to stress such as re-endothelialization post vascular injury, an important process for restoring tissue homeostasis and avoiding persistent inflammation and maladaptive remodeling. I subjected WT, STING-/-, and EC-STING-/- mice to wire induced carotid injury, an experimental model of vascular injury that mimics the EC damage induced by Percutaneous Coronary Interventions (PCI). I found that STING-/- mice exhibited delayed re-endothelialization and that EC-STING-/- mice recapitulated the phenotype of the global STING-/- mice, supporting a role for EC STING in reendothelialization post injury. Mechanistically, I performed scratch assays on WT and STING-/- mouse heart EC monolayers, as well as on human HUVEC monolayers cells lacking STING after CRISPR knock down. Real time imaging indicated that in EC lacking STING, longer healing times were needed post scratch, indicating roles of STING signaling in wound healing.Taken together, this body of work contributes novel insights into novel mechanisms that involve T cell CD43 and EC-STING, which may be modulated In T cells and the vascular endothelium to harness T cell mediated acute and chronic Inflammation.

Η διαδικασία μετακίνησης λευκοκυττάρων είναι μια καλά ενορχηστρωμένη διαδικασία διαδοχικών συμβάντων που οδηγεί τα φλεγμονώδη κύτταρα να διασχίζουν το αγγειακό τοίχωμα και να φτάνουν σε περιφερειακούς ιστούς. Επομένως, η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο τα επιφανειακά μόρια των λευκοκυττάρων αντιδρούν με μόρια σηματοδότησης και προσκόλλησης του αγγειακού ενδοθηλίου είναι υψίστης σημασίας. Στην παρούσα διατριβή, εξέτασα το ρόλο καλύτερα του διαμεμβρανικού μορίου CD43 των Τ-λεμφοκυττάρων και του ενδοκυτταρικού ενδοθηλιακού μορίου STING στην διαδικασία μεταφοράς λευκοκυττάρων και σε φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Η CD43 είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που λειτουργεί ως ligand της Ε-σελεκτίνης για κύτταρα Th17 σε in vitro συνθήκες και απαιτείται για την κύλιση πάνω στο αγγειακό ενδοθήλιο και την πρόσληψη κυττάρων Th17, κατά τη διάρκεια της φλεγμονής in vivo. Σε αυτή τη διατριβή διερεύνησα πώς η CD43 ρυθμίζει τα βήματα των κυττάρων Th17 που απαιτούνται για την μετακίνηση λευκοκυττάρων. Βρήκα ότι η CD43 προάγει την εξαρτώμενη από την ICAM-1 προσκόλληση Th17 κυττάρων, την κορυφαία μετανάστευση και τη διαπίδυση (ΤΕΜ) των Th17 κυττάρων. Η πρωτεινη STING ανιχνεύει κυκλικά δι-νουκλεοτίδια που απελευθερώνονται ως απόκριση στο δίκλωνο DNA και λειτουργεί ως προσαρμοστικό μόριο για τη σηματοδότηση ιντερφερόνης τύπου Ι (IFN-I, ενεργοποιώντας γονίδια διεγερμένα με IFN-I (ISG). Διερεύνησα τους ρόλους του STING στην πρόσληψη Τ κυττάρων ως απόκριση στην οξεία περιτονίτιδα, σε ένα μοντέλο καρδιακής ανεπάρκειας δια πίεσης-υπερφόρτωσης, καθώς και στο πλαίσιο αγγειακού τραυματισμού. Βρήκα ότι η διείσδυση Τ κυττάρων στο περιτόναιο σε απόκριση σε TNF-α εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την έκφραση STING σε ενδοθηλιακά κύτταρα (EK). Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, δημιούργησα ένα νέο ποντίκι που δεν εκφραζει ειδικά και χρονικά το STING αποκλειστικά στα EK. Η διαπίδυση λεμφοκυττάρων όταν το STING δεν υπάρχει στα EK του ποντικού και του ανθρώπου μειώθηκε εντυπωσιακά σε σύγκριση με τα control groups, ενώ η προσκόλληση Τ κυττάρων δεν επηρεάστηκε. Μηχανιστικά, αναγνώρισα τον άξονα EK IFN-I-IFNAR ως κρίσιμο στην αλληλουχία διαδικασιών σηματοδότησης που καταλήγει στη διαπίδυση Τ-λεμφοκυττάρων, ως απόκριση σε TNF-α φλεγμονώδη αντίδραση, και ταυτοποίησα το CXCL10, ένα ISG ως βασικό χημειοτακτικό σήμα για τα Τ κύτταρα, σε αυτή τη διαδικασία. Επειδή η μετακίνηση Th1 κυττάρων είναι ένα κρίσιμο βήμα για την καρδιακή φλεγμονή και την καρδιακή ανεπάρκεια -που προκαλείται από υπερφόρτωση πίεσης- διερεύνησα την πιθανή συμμετοχή του STING σε αυτή τη διαδικασία. Έδειξα ότι τα ποντίκια STING-/- εμφάνισαν μειωμένη καρδιακή ίνωση και υπερτροφία της αριστερής κοιλίας κάτι που συσχετίστηκε με μειωμένη καρδιακή ανεπάρκεια. Τα ευρήματά μου επισημαίνουν έναν ρόλο του STING στην καρδιακή φλεγμονή και ανοίγουν έναν δρόμο για τη διερεύνηση του συγκεκριμένου ρόλου του ενδοθηλιακού STING σε αυτό το μοντέλο. Υπέθεσα επίσης ότι το EΚ STING διαμορφώνει άλλες πτυχές των αντιδράσεων της ΕΚ στο στρες, όπως η εκ νέου ενδοθηλίωση μετά από αγγειακό τραυματισμό, μια σημαντική διαδικασία για την αποκατάσταση της ομοιόστασης των ιστών και την αποφυγή της επίμονης φλεγμονής και ομοιόστασης. Υπέβαλα ποντίκια WT, STING - / - και EΚ-STING - / - σε τραυματισμό καρωτίδας που προκλήθηκε από wire, ένα πειραματικό μοντέλο αγγειακής βλάβης που μιμείται τη βλάβη EΚ που επάγεται από Διαδερμικές Στεφανιαίες Παρεμβάσεις (PCI) και επεμβάσεις stent. Διαπίστωσα ότι τα ποντίκια STING - / - παρουσίασαν καθυστερημένη επανενδοθηλίωση και ότι τα ποντίκια EΚ-STING - / - είχαν τον ίδιο φαινότυπο με STING - / - ποντίκια, υποστηρίζοντας ένα ρόλο για το EΚ STING στην επούλωση αγγειακών τραυματισμών. Μηχανιστικά, έκανα wound healing assays σε μονοστιβάδες EΚ καρδιακού ποντικιού WT και STING, καθώς και σε κύτταρα μονοστιβάδων ανθρώπινων (HUVEC) που στερούνται STING. Η απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο έδειξε ότι στα ΕΚ χωρίς STING, χρειάστηκαν μεγαλύτεροι χρόνοι επούλωσης υποδεικνύοντας ρόλους της σηματοδότησης STING στην επούλωση πληγών. Συνολικά, η παρούσα διατριβή συμβάλει στην ανάδειξη νέων μηχανισμών στους οποίους εμπλέκονται οι πρωτεΐνες CD43 και STING.