Ιστολογική μελέτη των επιδράσεων της ενδοϋαλοειδικής χορήγησης αντιμυκητιακών φαρμάκων στον αμφιβληστροειδή: πειραματική μελέτη

Abstract

Endophthalmitis is one of the most devastating diseases in ophthalmology, often leading to partial or complete loss of vision in a short period of time, regardless of the infectious agent, which requires immediate and effective treatment. Although fungal endophthalmitis is rare in the spectrum of all intraocular infections, it remains a major clinical problem in ophthalmology due to its potentially devastating consequences. In addition, fungal ocular infections have traditionally been very difficult to treat due to the limited treatment options available both systemically and intravitrealy. In the past, Amphotericin B (AMB) was the only antifungal agent approved for intravitreal administration. However, amphotericin B has been reduced due to significant nephrotoxicity and relatively low intraocular penetration, retinal necrosis caused at low concentrations as well as the development of resistance to its action by many fungal species, necessitating the use of other antifungals with fewer side effects and probably more effective in treating fungal endophthalmitis. In fact, in recent years, there have been significant steps in the development of antifungal agents. Newer antifungal drugs have broad-spectrum antifungal activity, good bioavailability through various routes of administration, and ocular penetration. The newest representatives of these drugs studied in the present study are Voriconazole, from the class of Azoles and Micafungin, from the class of Echinocandins. A protocol was implemented using albino New Zealand rabbits. Both eyes of each animal were used. The right eyes of the animals were the study group, while the left eyes of the animals were the control group for the infusion of each drug respectively. All drugs were administered by intravitreal injection. Voriconazole solution was administered at a dose of 40 μg / 0.1ml to achieve an intravitreal concentration of 25μg / ml, while micafungin solution was administered at a dose of 25μg / 0.1ml, i.e. the highest safe dose according to the literature. More specifically, subgroups C1 and C2 were the control groups in which one and two injections of 0.1ml BSS solution were injected, respectively. Subgroups V1 and V2 were the study groups for single and double injection of voriconazole respectively. Subgroups M1 and M2 were the study groups for single and double injection of micafungin respectively. While the VM group was the study group for the combined injection of voriconazole and micafungin. The first injection was performed on day 0, the second injection on day 4 and the scheduled euthanasia of the animals was performed 10 days after the end of the intravitreal injections. An ophthalmological examination was also performed prior to the euthanasia. This was followed by the removal of the eyes and taking samples from the retinas, in order to undergo the appropriate preparation for observation under the optical microscope and the application of immunohistochemical stainings, as well as under the electron microscope. Regarding the results of the observation of the samples, voriconazole in both single and double injection protocol does not cause microscopic lesions but ultrastructural lesions. In fact, with one injection, lesions are found in the nerve fiber layer, in the ganglion cell layer and in the outer nuclear layer, while with two injections, more severe lesions are found in the aforementioned layers as well as additionally in the inner nuclear layer and in the layer of rods and cones. Micafungin in a single injection protocol does not cause microscopic lesions, while the two injections protocol causes lesions in the ganglion cell layer. However, ultrastructural lesions in almost all retinal layers are found in all specimens with both single and double micafungin injections, and in fact with the double injection’s lesions being more extensive and pronounced than the ones of the single injection. Co-administration of voriconazole and micafungin caused both microscopic and ultrastructural lesions in almost all layers, especially in the ganglion cell layer and the layer of rods and cones. Regarding the immunohistochemical staining for marker TNF-a, it was negative in all subgroups except the eyes with the combined infusion of voriconazole and micafungin in which it was detected as mildly positive in the presence of apoptotic cells in the ganglion cell layer in 2 of the 3 eyes of the subgroup. Regarding the staining for marker IL-6, it was negative in all subgroups except the eyes with a single injection of voriconazole in which it was detected as mildly positive in all samples. In conclusion, voriconazole appears to be more toxic in a multi-dose protocol. The immunohistochemical marker TNF-a does not seem to play a pathogenetic role in the lesions caused by voriconazole in the retina. On the contrary, the conclusions regarding the role of IL-6-mediated inflammation in causing retinal lesions by voriconazole are contradictory. As for micafungin, it is toxic to the retina and based on the extent and intensity of its caused lesions it seems to be more toxic than voriconazole. However, the TNF-a and IL-6 immunohistochemical markers do not appear to play a pathogenetic role in micafungin-induced retinal lesions. Finally, toxic effect on the retina caused by the combination of the two antifungal agents was found with TNF-a-mediated apoptosis appearing to belong to the mechanisms of retinal damage caused by the combined administration of voriconazole and micafungin. In contrast, IL-6-mediated inflammation does not appear to contribute to retinal lesions caused by the combined administration of the two agents.

Η ενδοφθαλμίτιδα αποτελεί μια από τις πιο καταστροφικές παθήσεις στην οφθαλμολογία οδηγώντας συχνά σε μερική ή πλήρη απώλεια της όρασης μέσα σε σύντομο χρονικό διάστημα, ασχέτως του λοιμογόνου παράγοντα, γεγονός που απαιτεί άμεση και αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση. Αν και η μυκητιασική ενδοφθαλμίτιδα είναι σπάνια στο σύνολο των ενδοφθάλμιων λοιμώξεων, παραμένει ένα σημαντικό κλινικό πρόβλημα στην οφθαλμολογία λόγω των δυνητικά καταστροφικών συνεπειών της. Επιπρόσθετα, οι οφθαλμικές λοιμώξεις από μύκητες ήταν παραδοσιακά πολύ δύσκολο να αντιμετωπιστούν λόγω των περιορισμένων θεραπευτικών επιλογών που υπήρχαν τόσο συστηματικά όσο και ενδοϋαλοειδικά. Στο παρελθόν, η Αμφοτερικίνη Β (AMB) αποτελούσε το μοναδικό αντιμυκητιακό παράγοντα με έγκριση για ενδοϋαλοειδική χορήγηση. Ωστόσο, η αμφοτερικίνη Β έχει περιοριστεί λόγω της σημαντικής νεφροτοξικότητας και της σχετικά χαμηλής ενδοφθάλμιας διείσδυσης, της αμφιβληστροειδικής νέκρωσης που προκαλεί σε χαμηλές συγκεντρώσεις καθώς και της ανάπτυξης αντίστασης στη δράση της από πολλά είδη μυκήτων, με αποτέλεσμα να δημιουργηθεί η ανάγκη χρήσης άλλων αντιμυκητιακών παραγόντων με λιγότερες ανεπιθύμητες ενέργειες και πιθανότατα με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα στη θεραπεία των μυκητιασικών ενδοφθαλμίτιδων. Μάλιστα, τα τελευταία χρόνια, υπήρξαν σημαντικά βήματα στην ανάπτυξη αντιμυκητιακών παραγόντων. Τα νεότερα αντιμυκητιακά φάρμακα έχουν αντιμυκητιακή δράση ευρέος φάσματος, καλή βιοδιαθεσιμότητα με διάφορες οδούς χορήγησης και οφθαλμική διείσδυση. Οι νεότεροι εκπρόσωποι αυτών των φαρμάκων που μελετήθηκαν στην παρούσα έρευνα είναι η Βορικοναζόλη, από την τάξη των Αζολών και η Μικαφουγκίνη, από την τάξη των Εχινοκανδινών. Υλοποιήθηκε πρωτόκολλο με χρήση κονίκλων albino New Zealand. Στους κονίκλους χρησιμοποιήθηκαν και οι δυο οφθαλμοί κάθε ζώου. Οι δεξιοί οφθαλμοί των ζώων αποτέλεσαν την ομάδα μελέτης, ενώ οι αριστεροί οφθαλμοί των ζώων αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου για την έγχυση του κάθε φαρμάκου αντίστοιχα. Όλα τα φάρμακα χορηγήθηκαν με ενδοϋαλοειδική έγχυση. Το διάλυμα βορικοναζόλης χορηγήθηκε σε δόση 40 μg/0.1ml για επίτευξη ενδοϋαλοειδικής συγκέντρωσης 25μg/ml, ενώ το διάλυμα μικαφουγκίνης χορηγήθηκε σε δόση 25μg/0.1ml, δηλαδή στην υψηλότερη ασφαλή δοσολογία σύμφωνα με τη βιβλιογραφία. Αναλυτικότερα, οι υποομάδες C1 και C2 αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου και σε αυτές χορηγήθηκαν μία και δύο εγχύσεις 0.1ml διαλύματος BSS, αντίστοιχα. Οι υποομάδες V1 και V2 αποτέλεσαν την ομάδα μελέτης για τη μονή και διπλή έγχυση βορικοναζόλης αντίστοιχα. Οι υποομάδες Μ1 και Μ2 αποτέλεσαν την ομάδα μελέτης για τη μονή και διπλή έγχυση μικαφουγκίνης αντίστοιχα. Ενώ η ομάδα VM αποτέλεσε την ομάδα μελέτης για τη συνδυαστική έγχυση βορικοναζόλης και μικαφουγκίνης. Η πρώτη ένεση πραγματοποιήθηκε την ημέρα 0, η δεύτερη ένεση την ημέρα 4 και η προγραμματισμένη θανάτωση των ζώων πραγματοποιήθηκε 10 ημέρες μετά το πέρας των ενδοϋαλοειδικών ενέσεων. Επίσης, προ της θανάτωσης πραγματοποιήθηκε οφθαλμολογικός έλεγχος. Ακολούθησε η αφαίρεση των οφθαλμών και η λήψη δειγμάτων από τους αμφιβληστροειδείς, ώστε να υποστούν την κατάλληλη επεξεργασία για παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο και για χρώσεις ανοσοϊστοχημείας, καθώς και στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Όσον αφορά τα αποτελέσματα της παρατήρησης των δειγμάτων, η βορικοναζόλη τόσο σε πρωτόκολλο μίας όσο και διπλής έγχυσης δεν προκαλεί μικροσκοπικές αλλοιώσεις αλλά υπερμικροσκοπικές αλλοιώσεις. Μάλιστα, με τη μία έγχυση ανευρίσκονται βλάβες στη στιβάδα των νευρικών ινών, στη στιβάδα των γαγγλιακών κυττάρων και στην έξω κοκκώδη στιβάδα, ενώ με τις δύο εγχύσεις ανευρίσκονται πιο έντονες βλάβες στις προαναφερθείσες στιβάδες καθώς και επιπρόσθετα βλάβες τόσο στην έσω κοκκώδη στιβάδα όσο και στη στιβάδα των ραβδίων και των κωνίων. Η μικαφουγκίνη σε πρωτόκολλο μίας έγχυσης δεν προκαλεί μικροσκοπικές αλλοιώσεις σε αντίθεση με τις δύο εγχύσεις της που προκαλούν αλλοιώσεις στη στιβάδα των γαγγλιακών κυττάρων. Ωστόσο, υπερμικροσκοπικές αλλοιώσεις σχεδόν σε όλες τις στιβάδες του αμφιβληστροειδούς ανευρίσκονται σε όλα τα δείγματα τόσο με τη μία όσο και με τις δύο εγχύσεις μικαφουγκίνης, και μάλιστα με τις αλλοιώσεις στη διπλή έγχυση να είναι πιο εκτεταμένες και έντονες σε σχέση με τη μία έγχυση μικαφουγκίνης. Στη συνδυαστική χορήγηση βορικοναζόλης και μικαφουγκίνης ανευρέθηκαν τόσο μικροσκοπικές όσο και υπερμικροσκοπικές αλλοιώσεις σχεδόν σε όλες τις στιβάδες και ιδιαίτερα στη στιβάδα των γαγγλιακών κυττάρων και των φωτοϋποδοχέων. Όσον αφορά την ανοσοϊστοχημική χρώση για τον δείκτη TNF-a, ήταν αρνητική σε όλες τις υποομάδες εκτός από τους οφθαλμούς με τη συνδυαστική έγχυση βορικοναζόλης και μικαφουγκίνης όπου ανιχνεύθηκε ως ήπια θετική με την παρουσία κυττάρων σε απόπτωση στη στιβάδα των γαγγλιακών κυττάρων στους 2 από τις 3 οφθαλμούς της ομάδας. Όσον αφορά τη χρώση για το δείκτη IL-6, ήταν αρνητική σε όλες τις υποομάδες εκτός από τους οφθαλμούς με μία έγχυση βορικοναζόλης όπου ανιχνεύτηκε ως ήπια θετική σε όλα τα δείγματα. Συμπερασματικά, η βορικοναζόλη φαίνεται πως είναι περισσότερο τοξική σε πρωτόκολλο περισσότερων δόσεων. O ανοσοϊστοχημικός δείκτης ΤNF-a δεν φαίνεται να διαδραματίζει παθογενετικό ρόλο στις αλλοιώσεις που προκαλεί η βορικοναζόλη στον αμφιβληστροειδή. Αντίθετα, αντικρουόμενα είναι τα συμπεράσματα όσον αφορά το ρόλο της διαμεσολαβούμενης από την IL-6 φλεγμονής στην πρόκληση αλλοιώσεων στον αμφιβληστροειδή από τη βορικοναζόλη. Όσον αφορά τη μικαφουγκίνη, είναι τοξική επί του αμφιβληστροειδούς και μάλιστα βάσει της έκτασης και της έντασης των ευρημάτων της φαίνεται ότι είναι πιο τοξική σε σχέση με τη βορικοναζόλη. Ωστόσο, οι ανοσοϊστοχημικοί δείκτες ΤNF-a και IL-6 δεν φαίνεται να διαδραματίζουν παθογενετικό ρόλο στις αλλοιώσεις που προκαλεί η μικαφουγκίνη στον αμφιβληστροειδή. Τέλος, ανευρέθηκε τοξική δράση επί του αμφιβληστροειδούς του συνδυαστικού σχήματος χορήγησης με την TNF-a διαμεσολαβούμενη απόπτωση να φαίνεται πως ανήκει στους μηχανισμούς της αμφιβληστροειδικής βλάβης που προκαλείται από τη συνδυαστική χορήγηση της βορικοναζόλης και της μικαφουγκίνης. Αντίθετα, η διαμεσολαβούμενη από την IL-6 φλεγμονή δε φαίνεται πως συμβάλλει στην πρόκληση αλλοιώσεων στον αμφιβληστροειδή από συνδυαστική χορήγηση των δύο παραγόντων.