Advances in non linear imaging microscopy for tissue and in-vivo biological samples characterization

Abstract

The use and development of spectroscopic techniques with emphasis on advanced microscopic methods for the timely and accurate diagnosis of diseases such as cancer or the need to understand some of the most important mechanisms of Biology, such as aging, based on observation and extraction of information at the cellular level is an interdisciplinary field of enormous research interest. Non-linear imaging microscopy is a reliable diagnostic tool for microscopic studies, as it is a minimally invasive technique with high resolution, while also providing the ability to simultaneously capture images through different non-linear signals such as: second and third harmonic generation (SHG / THG) or multiphoton excitation fluorescence (MPEF). During the present dissertation, studies were carried out that help the further development of the above techniques for the investigation of various biological problems. In addition, the creation of new data analysis algorithms and the implementation of artificial neural networks open new horizons in the fields of application of nonlinear microscopy.Specifically, the first of the above studies concerns the application of neural networks to THG images from human biopsy specimens for the accurate diagnosis of breast cancer at subcellular level. Although only the diagnosis of this type of cancer based on the imaging of unstained biopsies through THG was very innovative, it faced a key problem, the need for specialized staff to evaluate and separate the samples. THG mainly depicts optical inhomogeneities, lipids or cell membranes and the diagnosis is based on various characteristics of the cells such as their volume, their morphology and their emitted signal. However, locating cells in THG images is an extremely time consuming process and requires special experience, thus greatly limiting the use of this non-invasive diagnostic technique. The solution to this problem was given through the application of neural networks to categorize specific images. It is worth noting that the application of neural networks in THG images for the diagnosis of breast cancer was done for the first time and its success leads to the elimination of the need for specialized staff and the dramatic reduction of diagnostic time, thus bringing non-linear microscopy one step closer to clinical trials.The second study also concerns the diagnosis of breast cancer based on the above biopsies and non-linear microscopy, but this time the recorded non-linear signal was that of SHG. Tissues are rich in collagen fibers which is capable of emitting strong SHG signals. In recent years there have been several studies on the dependence of SHG on incoming polarization of radiation (PSHG) and on the quantified information obtained through it, such as the anisotropy parameter B. Through this parameter but also with the introduction of a new one (ratio parameter) it became possible to completely differentiate between all cancer stages of the biopsies we studied (from benign to third stage). The calculation of both of these parameters takes less than one second for each sample as it is based on the Fourier analysis of PSHG measurements. In addition, a biophysical model was proposed that interprets these results based on the mechanical strain applied to the collagen fibers during the various stages of cancer.In this dissertation, the capabilities of PSHG in combination with Fourier analysis were also used to study possible structural changes in the striated muscles of the model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans) during aging. The results of this study indicate that the striated muscle structure of C. elegans changes as the age of the sample increases. As far as is known, this is the first time that differentiation of the PSHG results has been observed through Fourier analysis from in-vivo muscle as the sample age increases. The differentiation was based on the difference of the spectral phases of the recorded PSHG signals. In addition, through the newly introduced ratio parameter, this study showed that the hitherto usual assumption of cylindrical symmetry for the biophysical model of PSHG lacks in satisfactory and complete description of the recorded data compared to the triangular symmetry, which in turn is inferior to the most general case where the sample does not need to have any particular symmetry.The last part of this thesis was dedicated to highlight the prospect of non-linear microscopy for application in material studies with the aim of delivering innovative results. Νon-linear measurements were used to study Cultural Heritage art works. Specifically, a specially designed algorithm was developed, which through MPEF measurements determines with great accuracy the thickness of the protective varnish layer in a work of art, thus helping in the process of its restoration.

Η χρήση και η ανάπτυξη φασματοσκοπικών τεχνικών με έμφαση στις προηγμένες μικροσκοπικές μεθόδους για την έγκαιρη και ακριβή διάγνωση ασθενειών όπως ο καρκίνος ή η ανάγκη για κατανόηση κάποιων από τους σημαντικότερους μηχανισμούς της Βιολογίας, όπως η γήρανση, βασιζόμενη στην παρατήρηση και την εξαγωγή πληροφοριών σε επίπεδο κυττάρου αποτελεί ένα διεπιστημονικό πεδίο με τεράστιο ερευνητικό ενδιαφέρον. Η μη γραμμική απεικονιστική μικροσκοπία είναι ένα αξιόπιστο διαγνωστικό εργαλείο για μελέτες σε μικροσκοπικό επίπεδο, μιας και είναι μια ελάχιστα επεμβατική τεχνική με υψηλή διακριτική ικανότητα, ενώ επιπλέον παρέχει την δυνατότητα για την ταυτόχρονη λήψη εικόνων μέσω διαφορετικών μη γραμμικών σημάτων όπως: γένεσης δεύτερης και τρίτης αρμονικής (SHG/ THG) ή του πολυφωτονικά διεγειρόμενου φθορισμού (MPEF). Κατά την παρούσα διατριβή, πραγματοποιήθηκαν μελέτες που βοηθούν την περαιτέρω εξέλιξη των παραπάνω τεχνικών για τη διερεύνηση ποικίλων βιολογικών προβλημάτων. Επιπλέον, η δημιουργία νέων αλγορίθμων ανάλυσης δεδομένων και η εφαρμογή τεχνητών νευρωνικών δικτύων ανοίγουν νέους ορίζοντες στα πεδία εφαρμογής της μη γραμμικής μικροσκοπίας. Συγκεκριμένα, η πρώτη από τις παραπάνω μελέτες αφορά την εφαρμογή των νευρωνικών δικτύων σε εικόνες THG από ανθρώπινα δείγματα βιοψίας για την ακριβή διάγνωση του καρκίνου του μαστού σε υπό κυτταρικό επίπεδο. Αν και μόνο η διάγνωση αυτού του είδους καρκίνου με βάση την απεικόνιση άβαφων βιοψιών μεσώ THG, ήταν ιδιαίτερα καινοτόμος, αντιμετώπιζε ένα βασικό πρόβλημα, την ανάγκη εξειδικευμένου προσωπικού για την αξιολόγηση και τον διαχωρισμό των δειγμάτων. H THG απεικονίζει κυρίως οπτικές ανομοιογένιες, λιπίδια ή κυτταρικές μεμβράνες και η διάγνωση βασίζεται σε διάφορα χαρακτηριστικά των κυττάρων όπως ο όγκος τους η μορφολογία τους και το εκπεμπόμενο σήμα τους. Ωστόσο ο εντοπισμός των κυττάρων στις εικόνες THG είναι μια εξαιρετικά χρονοβόρα διαδικασία και απαιτεί ιδιαίτερη εμπειρία περιορίζοντας έτσι σε μεγάλο βαθμό την χρήση της συγκεκριμένης μη επεμβατικής διαγνωστικής τεχνικής. Η λύση σε αυτό το πρόβλημα δόθηκε μέσω της εφαρμογής των νευρωνικών δικτύων για την κατηγοριοποίηση των συγκεκριμένων εικόνων. Αξίζει να σημειωθεί ότι η εφαρμογή νευρωνικών δικτύων σε εικόνες THG για την διάγνωση του καρκίνου του μαστού έγινε για πρώτη φόρα και η επιτυχία της οδηγεί στην εξάλειψη της ανάγκης εξειδικευμένου προσωπικού και στην δραματική μείωση του χρόνο διάγνωσης φέρνοντας έτσι ένα βήμα πιο κοντά τη μη γραμμική μικροσκοπία σε κλινικές δοκιμές.Η δεύτερη μελέτη αφορά πάλι τη διάγνωση του καρκίνου του μαστού με βάση τις παραπάνω βιοψίες και τη μη γραμμική μικροσκοπία, όμως αυτή τη φορά το καταγραφόμενο μη γραμμικό σήμα ήταν αυτό της SHG. Οι ιστοί είναι πλούσιοι σε ίνες κολλαγόνου το οποίο είναι ικανό να εκπέμπει ισχυρά SHG σήματα. Τα τελευταία χρόνια έχουν πραγματοποιηθεί αρκετές μελέτες πάνω στην εξάρτηση της SHG από την εισερχόμενη πόλωση της ακτινοβολία (PSHG) και στις ποσοτικοποιημένες πληροφορίες που προκύπτουν μέσω αυτής όπως για παράδειγμα η παράμετρος ανισοτροπίας Β. Μέσω αυτής της παραμέτρου αλλά και με την εισαγωγή μιας νέας (ratio parameter) κατέστη δυνατός ο πλήρης διαχωρισμός μεταξύ όλων των καρκινικών σταδίων των υπό μελέτη βιοψιών (από καλοήθης έως και τρίτου σταδίου). Ο υπολογισμών και των δύο αυτών παραμέτρων διαρκεί λιγότερο από ένα δευτερόλεπτο για κάθε δείγμα μιας και βασίζεται στην ανάλυση Fourier των PSHG μετρήσεων. Επιπλέον, προτάθηκε ένα βιοφυσικό μοντέλο το οποίο ερμηνεύει αυτά τα αποτελέσματα με βάση τις μηχανικές τάσεις που εφαρμόζονται στις ίνες κολλαγόνου κατά τα διάφορα στάδια του καρκίνου.Στο πλαίσιο αυτής της διατριβής οι δυνατότητες της PSHG σε συνδυασμό με την ανάλυση Fourier χρησιμοποιήθηκαν και για τη μελέτη πιθανών δομικών αλλαγών στους ραβδωτούς μύες του πρότυπου οργανισμού Caenorhabditis elegans (C. elegans) κατά τη γήρανση. Τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας υποδεικνύουν ότι η δομή των ραβδωτών μυών του C elegans μεταβάλλεται καθώς αυξάνεται η ηλικία του δείγματος. Από όσο είναι γνωστό, είναι η πρώτη φορά που παρατηρείται διαφοροποίηση των εξαγόμενων PSHG αποτελεσμάτων μέσω ανάλυσης Fourier από μύες in-vivo καθώς αυξάνεται η ηλικία του δείγματος. Η διαφοροποίηση στηρίχτηκε στη διαφορά των φασματικών φάσεων των καταγραφόμενων PSHG σημάτων. Επιπλέον μέσω της νεοεισαχθήσας παραμέτρου ratio η συγκεκριμένη μελέτη έδειξε ότι η μέχρι τώρα συνήθης παραδοχή της κυλινδρικής συμμετρίας για το βιοφυσικό μοντέλο της PSHG υστερεί στην ικανοποιητική και ολοκληρωμένη περιγραφή των καταγραφόμενων δεδομένων σε σχέση με την τριγωνική συμμετρία, η οποία με την σειρά της, υπολείπεται συγκρινόμενη με την πιο γενική περίπτωση όπου το δείγμα δεν είναι απαραίτητο να διακατέχεται από κάποια συγκεκριμένη συμμετρία.Το τελευταίο μέρος της παρούσας διατριβής αφιερώθηκε στην ανάδειξη της δυνατότητας της μη γραμμικής μικροσκοπίας για εφαρμογή σε μελέτες υλικών έχοντας ως στόχο την απόδοση καινοτόμων αποτελεσμάτων. Mη γραμμικές μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν για την μελέτη έργων Πολιτιστικής κληρονομιάς. Συγκεκριμένα, αναπτύχθηκε ένας ειδικά σχεδιασμένος αλγόριθμος, ο οποίος μέσα από μετρήσεις MPEF προσδιορίζει με μεγάλη ακρίβεια το πάχος του προστατευτικού στρώματος βερνικιού σε ένα ομοίωμα έργου τέχνης βοηθώντας έτσι, στη διαδικασία αποκατάστασης αυτού.