Γενετική μελέτη της ενδομητρίωσης στην Ελλάδα στη σύγχρονη μεταγονιδιωματική εποχή

Abstract

INTRODUCTION: Endometriosis is a complex gynecological disorder, affecting up to 10% of women of childbearing age, characterized by the presence of functional endometrial tissue at ectopic positions generally within the peritoneum. It is a heritable condition influenced by multiple genetic, epigenetic and environmental factors, with an overall heritability estimated at approximately 50%. AIM OF THE STUDY: The aim of the present study was to evaluate the association of rs1250248 and rs11674184 single nucleotide polymorphisms (SNPs), mapping to fibronectin 1 (FN1) and growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) genetic loci, respectively, with the risk of endometriosis. Moreover, we analyze the genetic variants conferring the risk of developing endometriosis in a unique family with 7 females with surgically confirmed endometriosis through whole exome sequencing (WES). Additionally, the study focused on a 67-year-old woman who presented with a 40-year history of familial endometriosis associated with various non-gynecological co-morbidities.Apart from that, we sought to clarify the structural/functional consequences of rs2305948, a common single nucleotide polymorphism (SNP) of VEGFR2 in endometriosis and to investigate the association of this SNP with susceptibility to endometriosis. SUBJECTS AND METHODS: A total of 166 women with endometriosis (stages I-IV), histologically confirmed, and 168 normal controls were recruited and genotyped. Genotyping of the rs1250248 and rs11674184 SNPs was performed with TaqMan primer/probe sets. Furthermore, WES was performed for the rare family using the AmpliSeq technology on the Ion Proton platform. 162 patients with endometriosis, histologically confirmed, and 170 women in the control group from a genetic homogeneous population were further evaluated for the V297I (rs2305948) polymorphism through TaqMan technology. Three dimensional (3D) homology modeling was applied for the localization of the polymorphism under study on the VEGFR2 protein. RESULTS:A significant association was detected with the A allele, as well as the AA and AG genotypes of rs1250248 (FN1) in patients with endometriosis, as well as in patients with stage I and II of the disease only. The rs11674184 SNP of the GREB1 gene was not found to be associated with an increased susceptibility to endometriosis either for all patients (stages I-IV) or for subgroups of stage I and II or III and IV of the disease only. As far as the unique family is concerned, an initial analysis of 64 variants that were detected across the 14 genes previously confirmed to be associated with endometriosis, did not identify any deleterious exonic variants in these genes. However, further analysis revealed 2 hemizygous deletions in the grandmother that segregate in several of her affected offspring. The first deletion was found in the UGT2B28 locus, spanning 7 informative sequence variants across at least 14 kb. The second deletion, located in USP17L2, spans 3 informative variants across at least 2 kb. Regarding VEGFR2, modeling revealed that the V297I polymorphism may affect the efficiency of trans autophosphorylation and cell signaling. The results of statistical analysis revealed that there was no significant allelic and genotypic association of the rs2305948 SNP between the disease (stages I IV) and the control group. Further analysis did not reveal any association of this SNP with an increased susceptibility to endometriosis for stages I and II or III and IV of the disease only. CONCLUSIONS: Our results demonstrated a genetic association between the rs1250248 (FN1) SNP and endometriosis at both the genotypic and allelic level. Moreover, the present work identified, for the first time, a role of the UGT2B28 and USP17L2 genes in endometriosis and underlines the power of WES to decipher complex phenotypes. Apart from that, we observed that endometriosis can coexist with various chronic autoimmune diseases and other conditions, including non-gynecological malignancies, which possibly share a common genetic cause, a fact that should be taken into consideration seriously by clinicians. However, we did not succeed in confirming that VEGFR2 polymorphism contributes significantly either to an increased susceptibility for endometriosis or to the severity of this condition, demonstrating that it is difficult to identify generalizable risk alleles in endometriosis and highlighting the importance of conducting comparative studies in different populations in order to determine true risk alleles for this condition. Overall, by deciphering new biochemical pathways, we could develop new biomarkers, which could contribute in a personalized diagnosis and treatment, and detect new potential therapeutic targets.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η ενδομητρίωση αποτελεί μια πολύπλοκη γυναικολογική πάθηση, που επηρεάζει έως και το 10% των γυναικών αναπαραγωγικής ηλικίας και χαρακτηρίζεται από την παρουσία λειτουργικού ενδομητριοειδούς ιστού σε εκτοπικές θέσεις κυρίως εντός του περιτοναίου. Είναι μια κληρονομική κατάσταση που επηρεάζεται από πολλαπλούς γενετικούς, επιγενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες, με τη συμμετοχή της κληρονομικότητας να εκτιμάται περίπου στο 50%. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ: Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η συσχέτιση των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs) rs1250248 και rs11674184, που αντιστοιχούν στους γενετικούς τόπους FN1 και GREB1, αντίστοιχα, με τον κίνδυνο εμφάνισης ενδομητρίωσης στον Ελληνικό πληθυσμό. Περαιτέρω, μελετήσαμε τις γονιδιακές παραλλαγές που σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης ενδομητρίωσης σε μια μοναδική οικογένεια με 7 γυναίκες με χειρουργικά επιβεβαιωμένη ενδομητρίωση μέσω της αλληλούχισης όλων των εξωνίων του γονιδιώματος (WES). Επιπλέον, η μελέτη επικεντρώθηκε σε μια 67χρονη γυναίκα που παρουσίασε 40-ετές ιστορικό οικογενούς ενδομητρίωσης που σχετίζεται με διάφορες μη-γυναικολογικές συννοσηρότητες. Παράλληλα, μέσω της μοντελοποίησης των πρωτεϊνών επιδιώξαμε να διευκρινίσουμε τις δομικές/ λειτουργικές συνέπειες του rs2305948, ενός SNP του VEGFR2, στην ενδομητρίωση και να διερευνήσουμε την σύνδεση αυτού του SNP με μια αυξημένη προδιάθεση για ενδομητρίωση, πιθανώς επηρεάζοντας τα ενδοθηλιακά κύτταρα. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Συνολικά, 166 γυναίκες συμμετείχαν με ιστολογικά επιβεβαιωμένη ενδομητρίωση (στάδια I-IV), ενώ συγχρόνως 168 ασθενείς-μάρτυρες συγκεντρώθηκαν και γονοτυπήθηκαν. Η γονοτύπηση των πολυμορφισμών rs1250248 και rs11674184 πραγματοποιήθηκε με Taqman primer/probe sets.Παράλληλα, 162 ασθενείς με επιβεβαιωμένη ενδομητρίωση και 170 γυναίκες στην ομάδα ελέγχου επιλέχθηκαν για την γονοτύπηση του πολυμορφισμού V297I (rs2305948), μέσω της τεχνολογίας Taqman. Η Τρισδιάστατη (3D) μοντελοποίηση (Three-dimensional (3D) homology modeling) εφαρμόστηκε για τον εντοπισμό του υπό μελέτη πολυμορφισμού επί της πρωτεΐνης VEGFR2. Περαιτέρω, όσον αφορά τη σπάνια 7 μελή οικογένεια διεξήχθη αλληλούχιση όλων των εξωνίων του γονιδιώματος (WES). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ:Μια σημαντική συσχέτιση ανιχνεύθηκε με το αλληλόμορφο Α καθώς και με τους γονότυπους AA και AG του rs1250248 (FN1) σε ασθενείς με ενδομητρίωση και συγκεκριμένα σε ασθενείς στο στάδιο Ι και ΙΙ της νόσου. Το rs11674184 SNP του γονιδίου GREB1 δεν βρέθηκε να συνδέεται με αυξημένη προδιάθεση για ενδομητρίωση είτε για όλους τους ασθενείς (στα στάδια I-IV) είτε μόνο για τις υποομάδες των σταδίων Ι και II ή III και IV της νόσου. Παράλληλα, η μοντελοποίηση αποκάλυψε ότι ο πολυμορφισμός V297I μπορεί να επηρεάσει την αποτελεσματικότητα της trans-αυτοφωσφορυλίωσης και της κυτταρικής σηματοδότησης. Τα στατιστικά αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση του rs2305948 SNP μεταξύ της ομάδας ασθενών (σταδίου Ι-IV) και της ομάδας ελέγχου. Η περαιτέρω ανάλυση δεν αποκάλυψε καμία συσχέτιση αυτού του SNP με αυξημένη προδιάθεση για ενδομητρίωση για τα στάδια Ι και II ή III και IV της νόσου μόνο. Σχετικά με την επταμελή οικογένεια, η αρχική ανάλυση 64 σχετιζόμενων με ενδομητρίωση παραλλαγών που είχαν σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία αποκαλυφθεί μέχρι τώρα, και οι οποίες εδράζονται σε 14 διαφορετικά γονίδια, δεν επιβεβαιώθηκε στην παρούσα μελέτη. Ωστόσο, η εκτενής ανάλυση αποκάλυψε δύο ετερόζυγες ελλείψεις στη «γιαγιά» της οικογένειας, που διαχωρίζονται κατά τη μείωση σε αρκετούς από τους νοσούντες απογόνους της. Η πρώτη απαλοιφή βρέθηκε στην περιοχή του γονιδίου UGT2B28, καλύπτοντας επτά παραλλαγές αλληλουχιών μήκους τουλάχιστον 14kb. Η δεύτερη απαλοιφή, που βρίσκεται στο γονίδιο USP17L2, καλύπτει τρεις παραλλαγές σε ακολουθία τουλάχιστον 2kb.Τέλος,μέσω της αλληλούχισης όλων των εξωνίων του γονιδιώματος παρατηρήθηκε η παρουσία πολλαπλών, πιθανώς αιτιολογικών, μη συνώνυμων μεταλλάξεων στη γυναίκα 67 ετών με το 40ετές ιστορικό οικογενούς ενδομητρίωσης που σχετίζεται με διάφορες συννοσηρότητες. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Τα αποτελέσματά μας έδειξαν μια γενετική συσχέτιση μεταξύ του rs1250248 FN1 SNP και της ενδομητρίωσης τόσο σε επίπεδο γονοτύπου όσο και αλληλομόρφου. Επιπλέον, τα παρόντα στοιχεία εμπλέκουν δύο επιπρόσθετα γονίδια(UGT2B28 και USP17L2)στην παθογένεση της νόσου εκτός από αυτά που έχουν ήδη ταυτοποιηθεί από τις GWAS μελέτες, υπογραμμίζοντας τη δύναμη του WES να αποκρυπτογραφήσει σύνθετους φαινοτύπους. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρατηρήσαμε την συνύπαρξη της ενδομητρίωσης με διάφορες χρόνιες αυτοάνοσες ασθένειες και άλλες καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένων των μη γυναικολογικών κακοηθειών, οι οποίες πιθανώς μοιράζονται μια κοινή γενετική αιτία, γεγονός που πρέπει να ληφθεί σοβαρά υπόψη από τους κλινικούς ιατρούς. Ωστόσο, εκτός από τα δομικά δεδομένα που υποδηλώνουν ότι το rs2305948 SNP του γονιδίου VEGFR2 μπορεί να συνεισφέρει στην ανάπτυξη της ενδομητρίωσης, εμποδίζοντας την VEGF σηματοδότηση και αύξηση της αγγειογένεσης, στην παρούσα μελέτη αυτός ο SNP δεν βρέθηκε να συνδέεται με αυξημένη προδιάθεση για ενδομητρίωση. Εν κατακλείδι, μέσω της αποκρυπτογράφησης νέων βιοχημικών παθογενετικών μονοπατιών οδηγούμαστε στη δημιουργία γενετικών (βίο)-δεικτών και θεραπευτικών στόχων που θα προσφέρουν εξατομικευμένη διάγνωση και αντιμετώπιση.