Study of the mechanism underlying premature suture closure in the animal model of ERF-related craniosynostosis

Abstract

The formation of the human head is a complex process involving sequences of crosstalk events between different germ layers and tissues and spatiotemporal activation of a variety of molecular signaling cascades. Cranial sutures comprise the connective tissues between the bony elements of skull and have a critical role in the development and growth of the calvarial bones. Non committed mesenchymal stem cells are found to reside in the suture mesenchyme that once enter the intramembranous ossification pathway give rise to proliferating populations of osteoprogenitor and preosteoblast cells that eventually appose osteoblasts at the edges of the developing bones. Resorption and bone reshaping takes place by osteoclasts later too. The balance between all these populations of cells seems to be crucial for the suture patency and consequently for the coordination of skull and brain development. Distortion of this balance can lead to the premature closure of one or more of the cranial sutures, a condition termed craniosynostosis, with an occurrence rate of approximately one in 2500 births, that results in abnormal head shapes along with vision, hearing and mental impairment unless treated. During the last decades, considerable amount of effort has been put into the identification of the mechanisms that lead to the appearance of the phenotype. However, the presence of multiple cell populations in sutures, the lack of specific cellular markers and the difficulties in the isolation of suture stem cells, hinder such efforts. Haploinsufficiency of the ETS-DNA binding transcriptional repressor factor ERF causes premature suture closure in humans and in ErfLoxP/- mice expressing only 29% of the normal Erf protein levels. Like humans, ErfLoxP/- mice display facial dysmorphism with no other obvious skeletal defects beyond synostosis which is preceded by a reduction in the ossification of calvarial bones at the onset of postnatal life. In previous studies ERF has been shown to regulate cellular proliferation downstream of ERK1/2 signalling along with differentiation processes with particular respect to trophoblast stem cell and erythroid differentiation. There were no reports however, about its role in either bone formation or craniofacial development. The aim of the current study was to provide an understanding of the mechanisms underlying the emergence of ERF-associated craniosynostosis phenotype, often characterised as insidious due to its high complexity. In the present study, we established in vitro cultures of primary suture-derived cells and developed selective conditions for the expansion of a mesenchymal stem/ progenitor cell population from suture explants to study the role of Erf in cranial suture fate and intramembranous skull ossification. By performing ex vivo cellular assays and transcriptomic analysis we provide evidence that Erf is required for the initial commitment of suture mesenchymal stem/ progenitor cells towards the osteogenic lineage, while at a later stage seems to be also essential for the maintenance of committed proliferating progenitor cells undergoing differentiation. Our data indicate that Erf affects the commitment and differentiation of cranial suture mesenchymal stem/ progenitor cells via the retinoic acid (RA) pathway. Decreased levels of Erf lead to increased expression of Cyp26b1 gene, encoding the RA-catabolizing enzyme, resulting in sustained proliferation and decreased mesenchymal stem cell differentiation. Exogenous addition of retinoic acid rescues the osteogenesis defect of Erf-insufficient (ErfLoxP/-) cells. The abnormal mineralization of the calvarial bones may be attributed to the distortion in retinoic acid concentration gradient during skull development. Further studies would be necessary to explore the spatiotemporal function of Erf and its effect on RA concentration gradients in cranial bone and suture development. Pharmacological enhancement of nuclear Erf action as well as retinoic acid level modulation hold promise for the treatment of craniosynostosis and reassert that continuous ERF presence is required for normal craniofacial development.

Η ανάπτυξη της κεφαλής του ανθρώπου αποτελεί μία πολύπλοκη διαδικασία που εμπλέκει την αλληλεπίδραση ιστών προερχόμενων από διαφορετικές βλαστικές στιβάδες του εμβρύου καθώς και την ενεργοποίηση ποικίλων μοριακών σηματοδοτικών μονοπατιών σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα και τοπολογίες. Οι κρανιακές ραφές αποτελούν το συνδετικό ιστό που υπάρχει μεταξύ των οστών του κρανίου και κατέχουν κύριο ρόλο στην αύξησή τους κατά την ανάπτυξη. Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που εντοπίζονται στην κεντρική περιοχή της ραφής ακολουθούν την οδό της ενδομεμβρανώδους (ή υμενογενούς) οστεοποίησης και διαφοροποιούνται σε οστεοπρογονικά και προ-οστεοβλαστικά κύτταρα με ικανότητα αυτοανανέωσης, τα οποία στη συνέχεια με τη σειρά τους διαφοροποιούνται σε οστεοβλάστες που εναποθέτουν εξωκυττάρια ύλη στις άκρες των οστών προς αύξηση (οστεογονικά μέτωπα). Αργότερα κατά την ανάπτυξη, οστική απορρόφηση από τους οστεοκλάστες και αναδόμηση λαμβάνουν επίσης χώρα στις κρανιακές ραφές. Η ισορροπία μεταξύ όλων αυτών των διαφορετικών κυτταρικών πληθυσμών –από τα πρόδρομα μεσεγχυματικά κύτταρα μέχρι τους οστεοβλάστες και τους οστεοκλάστες- είναι κρίσιμη για το εάν η ραφή θα παραμείνει ανοιχτή, χωρίς να οστεοποιηθεί πρόωρα, και συνεπώς είναι καθοριστική για την συντονισμένη αύξηση κρανίου και εγκεφάλου. Η αλλοίωση αυτής της ισορροπίας δύναται να οδηγήσει στο πρόωρο κλείσιμο της ραφής, μία πάθηση που καλείται κρανιοσυνοστέωση και εμφανίζεται με συχνότητα μία στις 2500 γεννήσεις. Αποτέλεσμα είναι συχνά η παραμόρφωση του σχήματος της κεφαλής, καθώς επίσης και προβλήματα στην όραση, την ακοή και την νοητική λειτουργία αν δεν υπάρξει άμεση χειρουργική παρέμβαση. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών σημαντικές προσπάθειες καταβάλλονται στη διερεύνηση των μηχανισμών που οδηγούν στην εμφάνιση του φαινοτύπου της κρανιοσυνοστέωσης. Όμως η ύπαρξη πολλαπλών κυτταρικών πληθυσμών στις ραφές, η απουσία χαρακτηριστικών κυτταρικών μαρτύρων, καθώς και οι δυσκολίες στην απομόνωση και ταυτοποίηση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων έχουν αποτελέσει τροχοπέδη στην πλήρη κατανόηση της παθοφυσιολογίας. Η απλοανεπάρκεια του μεταγραφικού καταστολέα ERF (ETS2 Repressor Factor) προκαλεί κρανιοσυνοστέωση στον άνθρωπο, αλλά και στα ποντίκια ErfLoxP/- τα οποία εκφράζουν μόνο το 29% των φυσιολογικών επιπέδων της πρωτεΐνης αυτής. Όπως οι άνθρωποι, έτσι και τα ποντίκια ErfLoxP/- εμφανίζουν δυσμορφία προσώπου, χωρίς όμως άλλες εμφανείς σκελετικές ανωμαλίες πέραν της συνοστέωσης και μια ελάττωση στην συνολική οστεοποίηση του κρανίου στις αρχές της μετεμβρυϊκής ζωής. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναδείξει την εμπλοκή του ERF στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καθοδικά του σηματοδοτικού μονοματιού των ERK1/2 κινασών, καθώς επίσης και στη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης με χαρακτηριστικότερα παραδείγματα τη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων και των αιμοποιητικών κυττάρων της ερυθρής σειράς. Καμία όμως αναφορά δεν υπήρχε σχετικά με τον πιθανό ρόλο του ERF στο σχηματισμό των οστών ή στην ανάπτυξη του κρανιοπροσωπικού συμπλέγματος. Στόχος λοιπόν της παρούσας μελέτης είναι να συμβάλλει στην κατανόηση του μηχανισμού που οδηγεί στην εκδήλωση του φαινοτύπου της σχετιζόμενης με τον ERF κρανιοσυνοστέωσης, φαινότυπος ο οποίος έχει χαρακτηρισθεί και ως «ύπουλος» λόγω της ετερογένειας που εμφανίζει στο χρόνο αλλά και την ένταση των συμπτωμάτων. Στην παρούσα μελέτη καθιερώσαμε in vitro πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων κρανιακών ραφών και αναπτύξαμε μια μέθοδο επιλεκτικής επιβίωσης και επέκτασης των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων ώστε να μελετηθεί ο ρόλος του παράγοντα ERF στις κρανιακές ραφές και την ενδομεμβρανώδη οστεογένεση του κρανίου. Μέσω ex vivo κυτταρικών δοκιμασιών και ανάλυσης του μεταγραφώματος, παρέχουμε στοιχεία που υποστηρίζουν ότι ο ERF είναι απαραίτητος για την αρχική δέσμευση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων προς την οστεογονική γενεαλογία, ενώ επιπλέον σε μετέπειτα στάδιο είναι σημαντικός για τη διατήρηση των πολλαπλασιαζόμενων οστεοπρογονικών κυττάρων που βρίσκονται καθ’ οδόν της πορείας διαφοροποίησης τους στις ραφές. Τα δεδομένα της μελέτης μας υποστηρίζουν ότι ο Erf ρυθμίζει τη δέσμευση και τη διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων προς οστεοπρογονικά κύτταρα μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού του ρετινοϊκού οξέος (RA). Συγκεκριμένα η ανεπάρκεια του Erf οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων του Cyp26b1, γονιδίου που κωδικοποιεί τον παράγοντα αποικοδόμησης του ρετινοϊκού οξέος, γεγονός που οδηγεί στη διατήρηση της αυτό-ανανέωσης των μεσεγχυματικών κυττάρων και της μείωσης του ρυθμού διαφοροποίησής τους. Η εξωγενής προσθήκη ρετινοϊκού οξέος επαναφέρει το φυσιολογικό πρότυπο in vitro διαφοροποίησης των ErfLoxP/- κυττάρων με βάση τα δεδομένα της μελέτης μας. Η παθολογική ασβεστιοποίηση των κρανιακών οστών δύναται να αποδοθεί στη διαταραχή της βαθμίδωσης συγκέντρωσης ρετινοϊκού οξέος. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται όμως για τον καθορισμό του ρόλου του Erf και του RA σηματοδοτικού μονοπατιού στα επιμέρους στάδια της οστεογένεσης. Η φαρμακολογική ενίσχυση της πυρηνικής δράσης του ERF στα κύτταρα καθώς και η ρύθμιση των επιπέδων ρετινοϊκού οξέος θα μπορούσαν δυνητικά να αποτελέσουν μια υποσχόμενη προοπτική στην αντιμετώπιση της κρανιοσυνοστέωσης και αναδεικνύουν ότι η συνεχής παρουσία του παράγοντα αυτού είναι αναγκαία για τη φυσιολογική ανάπτυξη του κρανιοπροσωπικού συμπλέγματος.