Development and validation of phosphonate-based inhibitors and activitiy-based probes (ABPs) for detection and pharmacological targeting of kallikreins

Abstract

The generation of a novel activity-based probe (ABP) and inhibitor specific for kallikrein 7 (KLK7) and validation of its therapeutic effects in vivo is described here. KLK7 is a protease with well-established functions in skin inflammation and overdesquamation and in cancer. ABPs, on the other hand, are small molecules that recognise the active enzyme specifically. Thus, in contrast to antibody-based assays, ABPs are uniquely valuable tools for the detection and quantification of the active fraction of a given enzyme, as well as for in vivo imaging enzymatic activities.To generate the KLK7-ABP, an in silico approach was applied for the identification of a new KLK7-specific substrate. The substrate was modified to yield a specific and selective KLK7 phosphonate inhibitor (Boc-Phe-PheP-(OPh)2) that was biotinylated to yield an ABP (biotin-X-X-Phe-PheP-(OPh)2). In addition, a fluorescently quenched ABP (KLK7-qABP) was synthesized and validated in vitro by established analytical methods, as well as a new histochemical assay, named activography (Pampalakis et al., Chem Commun (Camb) 53: 3246-3248, 2017). It is shown that the developed KLK7-ABP recognizes the active form of human KLK7 in vitro, but also the endogenous human KLK7 and mouse Klk7 proteins in corresponding cell extracts and skin biopsies.The therapeutic potential of the KLK7-ABP and KLK7-inhibitor was demonstrated in vivo using Spink5-/-Klk5-/- mice. Spink5-/- mice represent an established preclinical model of the rare disease Netherton syndrome, but also for common atopic dermatitis. Netherton syndrome is a severe (potentially lethal) rare ichthyosis characterized by pathological skin ovedesquamation and constitutive inflammation. It is known that KLK7 is aberrantly high in the skin of Spink5-/- mice upon ablation of the Klk5 protease, i.e., in the studied Spink5-/-Klk5-/- mice, and is functionally implicated in pathology (Furio et al., 2015; Kasparek et al., 2017). Epidermal administration of both the KLK7 inhibitor and the ABP attenuated skin inflammation and overdesquamation significantly. These novel results provide preclinical proof-of-concept for potential therapeutic and diagnostic (theranostic) applications of the developed KLK7-ABP in skin pathologies and, potentially, in ovarian and pancreatic cancer, in which KLK7 has been implicated. Further, a KLK6-ABP (biotin-dPEG®4-His-Ile-Val-ArgP-(OPh)2) was generated with the same strategy to determine the active KLK6 protease in biological and clinical specimens, since it is well-established that KLK6 is implicated in Alzheimer's and Parkinson's disease and in different types of cancer. Until now, the roles of theranostic ABPs targeting multiple cathepsin cysteine proteases have been assessed for cancer and cardiovascular diseases (Ben-Nun et al., 2015; Weiss-Sadan et al., 2019). In terms of this thesis, novel ABP-inhibitors with dual functions accommodated on a single chemical scaffold were developed and validated against the KLK7 (Bisyris et al., 2021a and 2021b) and KLK6 serine proteases. Evidence is provided for their potential analytical, diagnostic, and therapeutic applications, which expands the use of ABPs as theranostic agents by demonstrating their application in targeting the kallikreins, the largest family of serine proteases in the human genome.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται ο σχεδιασμός και η σύνθεση ενός νέου ιχνηθέτη ενεργότητας (activity-based probe, ABP) και αναστολέων ειδικών για την καλλικρεΐνη 7 (KLK7), καθώς και η αποτίμηση των θεραπευτικών ιδιοτήτων τους in vivo. Η KLK7 είναι μία σερινοπρωτεάση η οποία έχει μελετηθεί ιδιαίτερα για τον ενεργό της ρόλο στην φλεγμονή και την αποφολίδωση του δέρματος, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνου. Οι ιχνηθέτες ενεργότητας (ABPs) είναι μικρά μόρια ικανά να αναγνωρίζουν ειδικά τις καταλυτικώς ενεργές μορφές των ενζύμων. Η ιδιότητά τους αυτή, τους καθιστά μοναδικά και ιδιαίτερα χρήσιμα εργαλεία για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση του ενεργού κλάσματος του ενζύμου, καθώς επίσης και για την in vivo απεικόνιση της ενζυμικής δραστηριότητας, με πολυάριθμες εφαρμογές στην βιοχημική ανάλυση, αλλά και στην μοριακή διάγνωση. Σημειώνεται ότι τα αντισώματα, που χρησιμοποιούνται στις διάφορες ανοσοδοκιμές, αναγνωρίζουν την ολική ποσότητα του ενζύμου στην οποία περιλαμβάνονται και ενζυμικώς ανενεργές μορφές, όπως για παράδειγμα προένζυμα, σύμπλοκα ενζύμου-αναστολέα, κολοβωμένες πρωτεΐνες που έχουν απωλέσει την ενζυμική ενεργότητα, κλπ. Για τον σχεδιασμό του ιχνηθέτη της KLK7 εφαρμόσαμε μια in silico προσέγγιση για τον προσδιορισμό ενός νέου υποστρώματος ειδικού για την KLK7. Τροποποίηση του πεπτιδικού υποστρώματος έδωσε τον φωσφωνικό αναστολέα (Boc-Phe-PheP-(OPh)2), ειδικό για την KLK7, ενώ ο ειδικός ιχνηθέτης ενεργότητας (biotin-X-X-Phe-PheP-(OPh)2) παρήχθη με βιοτινυλίωση του αναστολέα. Επιπλέον, συντέθηκε ένας ιχνηθέτης ABP με απόσβεση φθορισμού (KLK7-qABP, όπου q: quenched), ο οποίος αξιολογήθηκε in vitro με καθιερωμένες αναλυτικές μεθόδους, αλλά και με μία νέα μεθοδολογία ιστοχημικής ανάλυσης ενζύμων, την ακτιβογραφία (activography) (Pampalakis et al., Chem Commun (Camb) 53: 3246-3248, 2017). Πειραματικά δείχθηκε ότι ο ιχνηθέτης KLK7-ABP ανιχνεύει την ενεργή μορφή της ανθρώπινης KLK7, καθώς και την ενδογενή ανθρώπινη KLK7 και την Klk7 του ποντικού, σε εκχυλίσματα κυττάρων και βιοψίες δέρματος, αντίστοιχα. Οι θεραπευτικές δυνατότητες του αναστολέα και του ιχνηθέτη της KLK7 καταδείχθηκαν in vivo χρησιμοποιώντας ποντικούς Spink5-/-Klk5-/-. Το σύνδρομο Netherton είναι μια (ενίοτε θανατηφόρα) μορφή ιχθύωσης, η οποία χαρακτηρίζεται από παθολογική υπεραποφολίδωση του δέρματος και ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη φλεγμονή στην επιδερμίδα, με αποτέλεσμα την εκτεταμένη βλάβη του δερματικού φραγμού. Η νόσος οφείλεται στην ανεπάρκεια του αναστολέα σερινοπρωτεασών LEKTI λόγω μεταλλάξεων στο αντίστοιχο γονίδιο SPINK5, με αποτέλεσμα την έκτοπη ενεργοποίηση της πρωτεόλυσης στην επιδερμίδα των ασθενών με σύνδρομο Netherton, αλλά και των ποντικών Spink5-/- που αναπαράγουν την ανθρώπινη νόσο, και αποτελούν καθιερωμένο πρότυπο για την μελέτη του συνδρόμου Netherton και της ατοπικής δερματίτιδας. Επίσης, έχει δειχθεί ότι η πρωτεάση KLK7 είναι ενεργοποιημένη στο δέρμα των ποντικών Spink5-/-Klk5-/-, στους οποίους έχει αδρανοποιηθεί η πρωτεάση Klk5, και εμπλέκεται αιτιολογικά στην παθολογία του δέρματος (Furio et al., 2015; Kasparek el al., 2017). Επομένως οι ποντικοί αυτοί αποτελούν ιδανικό πρότυπο για την δοκιμή και αξιολόγηση αναστολέων της πρωτεάσης Klk7. Επιδερμική χορήγηση τόσο του αναστολέα όσο και του ABP της KLK7 εξασθένισε σημαντικά την φλεγμονή και την υπεραποφολίδωση του δέρματος. Τα δεδομένα αυτά παρέχουν προκλινικές ενδείξεις για την δυνητική θεραπευτική και διαγνωστική (θεραποδιαγνωστική / therapeutic and diagnostic: theranostic) χρήση του KLK7-ABP σε δερματικές παθολογίες, καθώς και σε καρκίνους των ωοθηκών και του παγκρέατος, όπου επίσης εμπλέκεται η KLK7. Με την ίδια στρατηγική αναπτύχθηκε ένας ΑΒΡ για την KLK6 (biotin-dPEG®4-His-Ile-Val-ArgP-(OPh)2) με σκοπό την ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό της ενεργούς KLK6 σε βιολογικά και κλινικά δείγματα, δεδομένου ότι η KLK6 εμπλέκεται στις νόσους Alzheimer και Parkinson, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνων. Μέχρι σήμερα, ο ρόλος θεραποδιαγνωστικών ABPs για τις κυστεϊνοπρωτεϊνάσες καθεψίνες έχει μελετηθεί και αξιολογηθεί σε καρκίνους και καρδιαγγειακές παθήσεις (Ben-Nun et al., 2015; Weiss-Sadan et al., 2019). Στην παρούσα διατριβή, για πρώτη φορά αναπτύχθηκαν και αξιολογήθηκαν νέοι αναστολείς-ABPs για την KLK7 (Bisyris et al, 2021a and 2021b) και την KLK6 με διττές λειτουργίες φιλοξενούμενες σε έναν πεπτιδικό σκελετό, δηλαδή αναστολέα και ιχνηθέτη, και με ποικίλες δυνατές θεραποδιαγνωστικές εφαρμογές. Η εφαρμογή τους στην στόχευση των καλλικρεϊνών, την μεγαλύτερη οικογένεια σερινοπρωτεασών του ανθρώπινου γονιδιώματος, η οποία καταδείχθηκε στην παρούσα διατριβή, διευρύνει γενικότερα την χρήση των ABPs ως θεραποδιαγνωστικών μέσων (theranostic agents).