Molecular and cellualr mechanisms activated in response to organismal and cellular stress

Abstract

In the presence of unfavorable conditions cells activate molecular pathways to maintain cellular and consequently organismal homeostasis. Dysregulation of these pathway may drive maladaptation and disease.To study stress at the organismal level, we focused on chronic pain. Regulator of G protein signaling 4 (RGS4) is a potent modulator of G protein-coupled receptor (GPCR) signal transduction that is expressed throughout the pain matrix. Here, we use genetic mouse models to demonstrate a role of RGS4 in the maintenance of chronic pain states in male and female mice. Using paradigms of peripheral inflammation and nerve injury, we show that prevention of RGS4 action leads to recovery from mechanical and cold hypersensitivity and increases motivation for wheel running. Similarly, RGS4KO eliminates the duration of nocifensive behavior in the second phase of the formalin assay. Using the Complete Freud’s adjuvant (CFA) model of hindpaw inflammation we also demonstrate that downregulation of RGS4 in the adult ventral posterolateral thalamic nuclei (VPL-THL) promotes recovery from mechanical and cold allodynia. RNA sequencing analysis of THL from RGS4WT and RGS4KO mice points to many signal transduction modulators and transcription factors that are uniquely regulated in CFA- treated RGS4WT cohorts. Ingenuity Pathway Analysis suggests that several components of glutamatergic signaling are differentially affected by CFA treatment between RGS4WT and RGS4KO groups. Notably, western blot analysis shows increased expression of metabotropic glutamate receptor 2 (mGluR2) in THL synaptosomes of RGS4KO mice at time points at which they recover from mechanical allodynia. Overall, our study provides information on a novel intracellular pathway that contributes to the maintenance of chronic pain states and points to RGS4 as a potential therapeutic target (Part A).To study cellular stress responses, we focus on T-cell acute lymphoblastic leukemia (T- ALL). Protein folding demands and genomic instabilities in tumor cells result in proteotoxic stress. To survive and counterbalance stress, cancer cells activate heat shock pathways and HSF1 factor. While NOTCH1-driven leukemic cells are critically addicted to heat shock factor 1 (HSF1) and maintain high heat shock protein 90 (HSP90) -epichaperome levels, it remains largely unexplored whether HSF1 is required for tumor initiation and maintenance. Here, we generate a transgenic mouse model with an accumulation of nuclear HSF1 protein, termed as HSF1 S303/7A , and we demonstrate a similar disease trajectory between HSF1 WT and S303/7A, suggesting that augmented HSF1 does not impact T-ALL initiation or progression upon NOTCH1 oncogenic induction; albeit, established tumors show HSF1 addiction. Given that the epichaperome supports tumor growth, we target the HSP90-epichaperome complexes using a tumor-specific HSP90 inhibitor, PU-H71. While we demonstrate that PU-H71 in vitro induces apoptosis preferentially in NOTCH1-driven T-ALL patient samples, we further reveal that PU-H71 is cytostatic irrespective of NOTCH1 status in T- ALL patient samples. Using patient-derived xenografts with increased NOTCH1 and elevated epichaperome levels, we show that PU-H71 can effectively attenuate T-ALL progression and increase animal survival. Yet, the PU-H71 treated mice still succumb to the disease, indicating the potential acquisition of resistance in the T-ALL cells. To study the molecular mechanisms underlying the PU-H71 resistance, we generated resistant T-ALL cell lines to PU-H71. Although human T-ALL cell lines display cell cycle arrest and undergo apoptosis following PU-H71 treatment, the resistant cells are still able to proliferate upon PU treatment. The expression profile unravels vast transcriptional alterations in genes encoding regulators of cell cycle and metabolism upon the gain of PU-H71 resistance. Pathway analysis predicts mainly metabolic rewiring in PU-H71-resistant T-ALL cells, possibly mediated by the hypoxia-induced factor-alpha (HIF-1α) pathway. Overall, our study highlights the critical role of HSF1 mainly in established tumors, demonstrates the beneficial targeting of HSP90-epichaperome complexes in human T-ALL therapy, and provides novel information regarding the adaptations of the leukemic cells undergo after the acquisition of PU-H71 resistance (Part B). In conclusion, this comprehensive study unveils mechanistic details of stress regulation both at the cellular and organismal level. At the systemic level, we demonstrate, for the first time, that RGS4 function in the thalamus contributes to pain chronification, while interventions in RGS4 activity promote recovery from chronic pain symptoms. These results provide molecular insights for the design of novel targeted therapies to overcome chronic pain, which is associated with multiple pathologies including rheumatoid arthritis, osteoarthritis, cancer pain, spinal cord injury, and multiple sclerosis. At the cellular level, we provide evidence that targeting the cellular stress response in acute leukemia is a promising therapeutic strategy. In addition, we illuminate the molecular adaptations that occur in leukemic cells after targeting regulators of stress response for long periods. Hence, this study suggests ways to circumvent drug resistance in leukemia, which could lead to the development of innovative and efficient combinational therapies. Collectively our findings point to novel avenues for efficient chronic pain medications and leukemia treatments to ultimately improve the lives of patients.

Οι μοριακοί μηχανισμοί συστημικού και κυτταρικού στρες είναι αναγκαίοι για τη διατήρηση της ομοιόστασης. Διατάραξη των μηχανισμών αυτών οδηγεί σε εμφάνιση παθήσεων.Για τη μελέτη του συστημικού στρες εστιάζουμε στον χρόνιο πόνο. Για τη θεραπεία του χρόνιου πόνου, οι πιο κοινοί φαρμακευτικοί στόχοι είναι οι πρωτεΐνες που συνδέονται με G- πρωτεΐνες. Η πρωτεΐνη ρυθμιστής των G- πρωτεϊνών 4, RGS4 εμφανίζει ένα ευρύ πεδίο έκφρασης σε περιοχές του εγκεφάλου που σχετίζονται με την ρύθμιση του πόνου και ο ρόλος στις περιοχές του εγκεφάλου σε συνθήκες χρόνιου πόνου ήταν άγνωστος. Στη παρούσα εργασία χρησιμοποιώντας γενετικά τροποποιημένα ποντίκια ως προς την έκφραση της RGS4 και μοντέλα χρόνιου φλεγμονώδη και νευροπαθητικού πόνου ανακαλύψαμε ότι η RGS4 πρωτεΐνη είναι υπεύθυνη για την διατήρηση του χρόνιου πόνου σε θηλυκά και αρσενικά ποντίκια. Συγκεκριμένα, η μελέτη μας έδειξε ότι παρέμβαση στην έκφραση της RGS4 πρωτεΐνης (χρησιμοποιώντας ποντίκια που δεν εκφράζουν την RGS4 πρωτεΐνη, και ως κοντρόλ ποντίκια που εκφράζουν την RGS4 πρωτεΐνη) οδηγεί σε πιο άμεση ανάρρωση από τα συμπτώματα της αλλοδυνίας (απόκριση σε μηχανικό ερέθισμα και απόκριση στο κρύο), το οποίο είναι το πιο κοινό σύμπτωμα του χρόνιου πόνου. Επιπλέον, ανακαλύψαμε ότι σε συγκεκριμένη περιοχή του εγκεφάλου, στον αισθητικό θάλαμο, η RGS4 πρωτεΐνη δρα και οδηγεί στην διατήρηση των συμπτωμάτων του χρόνιου πόνου. Στη συνέχεια, συγκρίναμε το προφίλ έκφρασης RNA μορίων του θαλάμου μεταξύ ποντικών που αναρρώνουν και δεν αναρρώνουν από την αλλοδυνία και εντοπίσαμε μεταγραφικούς παράγοντες και μόρια σηματοδότησης να ρυθμίζονται μόνο στον θάλαμο ποντικών που εκφράζουν την RGS4 πρωτεΐνη και δεν αναρρώνουν από την αλλοδυνία. Ανάλυση των σηματοδοτικών μονοπατιών έδειξε ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι του γλουταμινικού οξέος ρυθμίζεται διαφορετικά μεταξύ των δύο ομάδων ποντικών. Συγκεκριμένα, ανακαλύψαμε ότι η έκφραση του μεταβοτροπικού υποδοχέα του γλουταμινικού οξέος 2 είναι αυξημένη στον θάλαμο των ποντικών που αναρρώνουν από την αλλοδυνία. Η μελέτη μας παρέχει καινοτόμες πληροφορίες για τα ενδοκυττάρια σηματοδοτικά μονοπάτια στον εγκέφαλο που οδηγούν στην διατήρηση του χρόνιουπόνου και προτείνει ως νέα υποσχόμενη θεραπεία κατά του χρόνιου την στόχευση της RGS4 πρωτεΐνης (μέρος Α).Για να μελετήσουμε το κυτταρικό στρες εστιάσαμε στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία. Τα λευχαιμικά κύτταρα για να επιβιώσουν και πολλαπλασιαστούν ανεξέλεγκτα απαιτούν μεγάλες ποσότητες πρωτεϊνών, οι οποίες αναπόφευκτα ενεργοποιούν τους μηχανισμούς απόκρισης στο πρωτεϊνικό ή θερμικό στρες. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, όταν τα κύτταρα δεχθούν θερμικό σοκ ενεργοποιούν τον μεταγραφικό παράγοντα HSF1 προάγουν την έκφραση των HSP πρωτεϊνών. Ωστόσο, τα λευχαιμικά κύτταρα διατηρούν σταθερά υψηλά επίπεδα HSF1 για να πολλαπλασιάζονται συνεχόμενα χωρίς έλεγχο. Παρόλο που έχει αποδειχθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα χρειάζονται τον HSF1 για να επιβιώσουν, παραμένει άγνωστο εάν ο HSF1 είναι αναγκαίος για την έναρξη και επιτάχυνση της λευχαιμίας. Στη παρούσα μελέτη, δημιουργήσαμε ένα γονιδιακό μοντέλο ποντικού που εκφράζει μόνιμα την HSF1 πρωτεΐνη (HSF1S303/7A) . Εισήγαμε την έκφραση του ογκογονιδίου NOTCH1 στα διαγονιδιακά ποντίκια HSF1S303/7A και παρατηρήσαμε ότι δεν επηρεάζεται η έναρξη και η εξέλιξη της νόσου. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες στα λευχαιμικά κύτταρα σχηματίζουν πρωτεϊνικά συμπλέγματα για την βέλτιστη λειτουργία τους και στοχεύουμε αυτά τα συμπλέγματα χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αναστολέα που ονομάζεται PU-H71, ο οποίος στοχεύει την HSP90 πρωτεΐνη που είναι κύριο συστατικό αυτών των συμπλεγμάτων. Ανακαλύψαμε ότι ο PU-H71 επάγει κυτταρικό θάνατο σε λευχαιμικούς τύπους κυττάρων που εκφράζουν υψηλές τιμές του ογκογονιδίου NOTCH1, ενώ σε λευχαιμικούς τύπους κυττάρων που εκφράζουν χαμηλές τιμές NOTCH1 οδηγεί μόνο σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου. Πραγματοποιώντας πειράματα σε διαγονιδιακά ποντίκια μεταμοσχεύοντας ανθρώπινα λευχαιμικά κύτταρα (που εκφράζουν υψηλές τιμές του ογκογονιδίου NOTCH1 και μεγάλες ποσότητες πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων) χρησιμοποιώντας τον αναστολέα PU-H71 παρατηρήσαμε ότι επιβραδύνεται η εξέλιξη της νόσου. Παρόλο που ο αναστολέας επάγει κυτταρικό θάνατο και αναστολή πολλαπλασιασμού στα λευχαιμικά κύτταρα in vitro, παρατεταμένη επώαση με τον αναστολές οδηγεί σε ανθεκτικά κύτταρα στο PU-H71. Ενδιαφέρον είναι ότι ο HSF1 μειώνεται, ενώ η ποσότητα των πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων μειώνεται ελάχιστα στα ανθεκτικά κύτταρα, προτείνοντας ότι η αυξημένη έκφραση της HSP70 πουπαρατηρήσαμε αντισταθμίζει την μείωση της HSP90 που στοχεύετε από τον αναστολέα. Η ανάλυση της έκφρασης των RNA μορίων μεταξύ ανθεκτικών και μη ανθεκτικών κυττάρων έδειξε μεταγραφικές αλλαγές σε μεταγραφικό επίπεδο σε ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου και του μεταβολισμού. Η μελέτη μας προτείνει ότι η στόχευση των πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων στην οξεία λευχαιμία επιβραδύνει την νόσο και παρέχει καινοτόμες πληροφορίες για τις προσαρμογές που υφίστανται τα λευχαιμικά κύτταρα που παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στον PU-H71 (μέρος Β). Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη παρέχει πληροφορίες στους μηχανισμούς απόκρισης σε επίπεδο κυττάρου και οργανισμού. Σε συστημικό επίπεδο, ανακαλύψαμε ότι η RGS4 πρωτεΐνη δρα στον θάλαμο και προάγει τον χρόνιο πόνο και μειώνοντας την έκφρασή της επιταχύνεται η ανάρρωση από τον χρόνιο πόνο. Αυτά τα αποτελέσματα συμβάλλουν στην ανακάλυψη αποτελεσματικών θεραπειών του χρόνιου πόνου, ο οποίος εμφανίζεται σε πολλές παθήσεις όπως για παράδειγμα ρευματοειδή αρθρίτιδα, οστεοαρθρίτιδα, σκλήρυνση κατά πλάκας, βλάβη στην σπονδυλική στήλη και πόνο μετά την χημειοθεραπεία. Όσο αφορά το κυτταρικό επίπεδο, προτείνουμε μία εναλλακτική θεραπεία που στοχεύει τους μηχανισμούς στρες του λευχαιμικού κυττάρου και παράλληλα επισημαίνουμε τις πιθανές προσαρμογές των κυττάρων στην συγκεκριμένη θεραπεία, ώστε να αποφευχθεί η ανθεκτικότητα στους ασθενείς.