Ο ρόλος των υποδοχέων TrkA και p75NTR του νευροτροφικού παράγοντα NGF, στην πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα

Abstract

Nerve Growth Factor (NGF) and its receptors, Tropomyosin Receptor Kinase A (TrkA) and pan-neurotrophin receptor p75 (p75NTR), are known to play bidirectional roles between the immune and nervous system, especially regarding the inflammatory and autoimmune conditions such as the Multiple Sclerosis (MS). There are only few studies with inconclusive results concerning the expression pattern and role of NGF, TrkA and p75NTR under the neuroinflammatory conditions in MS and its mouse model, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Based on this, the present doctoral dissertation thoroughly investigates the NGF’s system expression in experimental animals during the EAE course. Real-time PCR, Western Blot, as well as histochemical and immunofluorescence stainings, were performed throughout the disease course for the detection of the spatio-temporal expression of each component of the NGF system. Our findings suggest that both NGF and its receptors, TrkA and p75NTR, are differentially regulated in different areas of the brain, whereas they are up-regulated during acute and chronic phase of the EAE model in the inflammatory lesions in the spinal cord. NGF and its receptors were co-localized with NeuN+ cells, GAP-43+ axons, GFAP+ cells, Arginase1+ cells, Mac3+ cells. Furthermore, TrkA and p75NTR were sparsely detected on CNPase+ cells within the inflammatory lesion. Of high importance is our observation that despite EAE being a T-mediated disease only NGF and p75NTR were shown to be expressed by B-lymphocytes (B220+ cells) and no expression on T-lymphocytes was noticed. Our results indicate that the components of the NGF system are subjected to differential regulation during the EAE disease course. The expression pattern of NGF, TrkA and p75NTR is described in detail, suggesting possible functional roles in neuroprotection, neuroregeneration and remyelination by direct and indirect effects on the components of the immune system.

Ο νευρικός αυξητικός παράγοντας (NGF) και οι υποδοχείς του, ο υποδοχέας κινάσης τροπομυοσίνης TrkA και ο υποδοχέας παν-νευροτροφινών p75NTR, έχουν διττό ρόλο στο ανοσιακό και το νευρικό σύστημα. Μοιράζονται και ρυθμίζουν κοινές λειτουργίες και σήματα, ειδικά όσον αφορά τις φλεγμονώδεις και αυτοάνοσες καταστάσεις όπως η Πολλαπλή Σκλήρυνση (ΠΣ). Υπάρχουν λίγες μόνο μελέτες με αντικρουόμενα αποτελέσματα σχετικά με το πρότυπο έκφρασης και τον ρόλο των NGF, TrkA και p75NTR στις νευροφλεγμονώδεις συνθήκες της ΠΣ και του ζωικού μοντέλου της, την Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα (ΠΑΕ). Με βάση τα παραπάνω, η παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνά την έκφραση του NGF συστήματος, σε πειραματόζωα στα οποία προκλήθηκε το μοντέλο της ΠΑΕ καθώς και σε πειραματόζωα μάρτυρες. Η μελέτη περιλαμβάνει τις απαραίτητες πειραματικές ομάδες πειραματοζώων: μάρτυρες, προσυμπτωματική, οξεία και χρόνια φάση, που καλύπτουν πλήρως την εκδήλωση και εξέλιξη της κλινικής πορείας της νόσου. Με τη χρήση μοριακών τεχνικών [αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) πραγματικού χρόνου και ανοσοστύπωμα κατά Western Blot] και ιστοχημικών χρώσεων και ανοσοφθορισμό, πραγματοποιήθηκε η ανίχνευση της χωροχρονικής έκφρασης των μορίων NGF, TrkA και p75NTR, καθ’ όλη τη διάρκεια του πειραματικού μοντέλου. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η έκφραση τόσο του πολυπεπτιδίου NGF όσο και των υποδοχέων του, TrkA και p75NTR, υπόκεινται σε διαφορική ρύθμιση σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου, ενώ υπερ-εκφράζονται κατά την οξεία και χρόνια φάση του μοντέλου της ΠΑΕ, στις φλεγμονώδεις βλάβες στο νωτιαίο μυελό. Ο NGF και οι υποδοχείς του συνεντοπίστηκαν με NeuN+ κύτταρα, GAP-43+ άξονες, GFAP+ κύτταρα, Arginase1+ κύτταρα και Mac3+ κύτταρα. Επιπλέον, οι TrkA και p75NTR ανιχνεύθηκαν σε χαμηλό ποσοστό σε CNPase+ κύτταρα, εντός της φλεγμονώδους βλάβης. Μεγάλη σημασία έχει η παρατήρησή μας ότι, παρά το γεγονός ότι η ΠΑΕ είναι μια νόσος που προκαλείται από Τ-λεμφοκύτταρα, δεν παρατηρήθηκε έκφραση του NGF συστήματος σε αυτά, ενώ δείχθηκε ότι μόνο ο NGF και ο p75NTR εκφράζονται στα Β-λεμφοκύτταρα (Β220+ κύτταρα). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα μόρια του συστήματος NGF υπόκεινται σε διαφορική ρύθμιση κατά την πορεία της νόσου της ΠAE στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ). Το πρότυπο έκφρασης των NGF, TrkA και p75NTR περιγράφεται λεπτομερώς, υποδηλώνοντας πιθανούς λειτουργικούς ρόλους όχι μόνο στη νευροπροστασία, στη νευροαναγέννηση και στην επαναμυελίνωση, αλλά πιθανώς έχει άμεσες και έμμεσες επιδράσεις στα στοιχεία του ανοσιακού συστήματος.