Μελέτη αξιολόγησης της βιοδραστικότητας συμπλόκων Ag (I) με οργανικούς υποκαταστάτες και εγκλωβισμός, ανάπτυξη και χαρακτηρισμός λιποσωμιακών νανοσυστημάτων μεταφοράς τους, σε καρκινικά in vitro και in vivo μοντέλα

Abstract

The value of chemotherapy still remains undisputed but new anticancer approaches are gaining more and more ground in the fight against cancer. The aim of this thesis was to investigate the bioactivity properties of 4 new mixed complexes of silver (I) with ligands triphenylphosphine and thioamides with molecular formulas AgCl(TPP)2(TZD) [1], AgCl(TPP)2(BZT) [2], AgCl(TPP)2(CBZT) [3], AgCl(TPP)2(MMI) [4], as potential anticancer agents and to determine their mechanism of action. Furthermore, studies of integration complexes into liposomes took place in order to improve their physicochemical properties and to increase their pharmacological activity offered by these systems. In vitro studies were performed in order to evaluate the inhibition of cell viability of these silver complexes, to detect the mechanism of cell death they cause and to evaluate their photoactivated cytotoxic actions after exposure to UVC radiation. The best cytotoxic properties revealed by complex [3] which was used for further evaluation. Furthermore, screening cytotoxic studies took place in numerous cancer cell lines for the detection of cell line selectivity. Additionally, the ability to inhibit tumor cell colony formation, cell cycle analysis and the mode of mechanism through DNA cross-linking was evaluated. Subsequent studies took place for the determination of suitable liposomal nanocarriers, for the physicochemical characterization of this liposomal nanosystem and for the evaluation of its cytotoxic properties in vitro. The in vivo studies included acute and chronic toxicity evaluation of the free form of complex [3] to healthy female Wistar rats and the evaluation of anticancer properties on leiomyosarcoma tumor-bearing female Wistar rats of the free and liposomal form of the complex. The complexes of Ag (I) exhibited strong cytotoxic activity which appeared statistically significant better than cisplatin. Photoactivation of complexes intracellularly with UVC caused an increase in their cytotoxic effects. The dose-dependently induced cell death caused through the mechanism of apoptosis. Additionally, complex [3] showed strong cytotoxicity to tumor cell lines tested but no cell line selectivity revealed. Furthermore, [3] showed dose-dependent inhibitory properties of colonies formation of tumor cells, cell-cycle independent action and no formation of cross-links with DNA. Incorporation (partitioning) of complex [3] was achieved in liposomes composed by EPC: DPPG and the molar ratio of the complex to the lipids of the liposomes (Drug / Lipid) was determined at 1.76x10-5 whereas the concentration at 0.584mM. Despite the small percentage of partitioning of [3] in liposomes, the liposomal formulation of the complex exhibited stronger in vitro cytotoxic activities compared to the free form (~ 25-fold lower IC50 value).The acute and chronic toxicity studies did not cause the death of any animal and histopathological examination showed very mild tissue damage. The evaluation of anticancer properties revealed statistically significant increase of the mean survival time of tumor-bearing rats which reached levels of 57.45% compared with the control group and were comparable between the high dose (6 x 27mg/kg BW) of the free form of complex [3] and liposomal form of complex [3] (6 x 0.0025mg/kg BW). The histopathological examination showed mild tissue damage (liver, lung) in the administered free form of the complex and on the other hand no tissue damage detected in the administration of liposomal form. These results highlight the usefulness of incorporation of liposomal nanotechnology in the strategic approach of the new metal-chemo-therapeutic agents to improve their strong pharmacological action by enhancing their anticancer therapeutic effect.

Η αξία της χημειοθεραπείας παραμένει ακλόνητη μέχρι σήμερα αλλά οι νέες αντικαρκινικές προσεγγίσεις κερδίζουν ολοένα και περισσότερο έδαφος στην καταπολέμηση του καρκίνου. Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο έλεγχος της βιοδραστικών ιδιοτήτων 4 νέων μεικτών-συμπλόκων του αργύρου (Ι) με υποκαταστάτες τριφαινυλοφωσφίνη και θειοαμίδια με μοριακούς τύπους AgCl(TPP)2(TZD) [1], AgCl(TPP)2(BZT) [2], AgCl(TPP)2(CBZT) [3], AgCl(TPP)2(MMI) [4], ως εν δυνάμει αντικαρκινικοί παράγοντες και ο προσδιορισμός του μηχανισμού δράσης τους. Επιπροσθέτως, πραγματοποιήθηκαν μελέτες ενσωμάτωσης των συμπλόκων σε λιποσώματα, για τη βελτίωση των φυσικοχημικών τους ιδιοτήτων και την αύξηση της φαρμακολογικής τους δραστικότητας που προσφέρουν τα συστήματα αυτά. Πραγματοποιήθηκαν in vitro μελέτες αξιολόγησης της αναστολής του κυτταρικής βιωσιμότητας των συμπλόκων του Ag(I), ανίχνευση του κυτταρικού μηχανισμού του θανάτου που προκαλούν, αξιολόγηση των φωτοενεργοποιούμενων κυτταροτοξικών τους δράσεων έπειτα από έκθεση σε UVC ακτινοβολία. Δραστικότερο όλων εμφανίστηκε το σύμπλοκο [3], με το οποίο συνεχίστηκε η μελέτη αξιολόγησης του. Έτσι μελετήθηκε σε πληθώρα καρκινικών σειρών προς ανίχνευση κυτταρικής επιλεκτικότητας. Επιπροσθέτως, αξιολογήθηκε η ικανότητα αναστολής σχηματισμού αποικιών καρκινικών κυττάρων, μελετήθηκαν οι δράσεις του συμπλόκου στον κυτταρικό κύκλο και ελέγχθηκε εάν ο μηχανισμός δράσης του προκαλείται μέσω διασταυρούμενων συνδέσεων με το DNA. Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκαν μελέτες ανεύρεσης κατάλληλου λιποσωμιακού νανοφορέα μεταφοράς του, πραγματοποιήθηκε ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός του συστήματος και ελέγχθηκαν οι in vitro κυτταροτοξικές του ιδιότητες. Οι in vivo μελέτες συμπεριέλαβαν μελέτες οξείας και χρόνιας τοξικότητας σε υγιείς θηλυκούς επίμυες Wistar της ελεύθερης χορηγούμενης μορφής του συμπλόκου καθώς και τις αντικαρκινικές ιδιότητες επί καρκινοπαθών με λειομυοσάρκωμα θηλυκών επίμυων Wistar της ελεύθερης και της λιποσωμιακής μορφής του συμπλόκου. Τα σύμπλοκα του Ag (I) επέδειξαν ισχυρή κυτταροτοξική δράση η οποία εμφανίστηκε στατιστικά σημαντικά καλύτερη από της cisplatin. Η ενδοκυτταρική φωτοενεργοποίηση των συμπλόκων με UVC προκάλεσε αύξηση των κυτταροτοξικών δράσεων τους. Ο κυτταρικός θάνατος επάγεται δοσοεξαρτώμενα μέσω του μηχανισμού της απόπτωσης. Επιπροσθέτως, το σύμπλοκο [3] επέδειξε ισχυρή κυτταροτοξικότητα στις καρκινικές σειρές που δοκιμάστηκε αλλά δεν εμφάνισε κυτταρική επιλεκτικότητα. Επιπροσθέτως, το [3] εμφάνισε δοσοεξαρτώμενες ιδιότητες αναστολής της δημιουργίας αποικιών των καρκινικών κυττάρων, δεν επέδειξε σχέση δράσης με τις φάσεις S και G2/M του κυτταρικού κύκλου και δεν αποκαλύφθηκε ότι δημιουργεί διασταυρούμενες συνδέσεις με το DNA. Επιτεύχθηκε η ενσωμάτωση του συμπλόκου [3] σε λιποσώματα σύστασης EPC:DPPG και η μοριακή αναλογία του συμπλόκου προς τα λιπίδια των λιποσωμάτων (Drug/Lipid) προσδιορίστηκε στα 1.76x10-5 ενώ η συγκέντρωση στα 0.584μΜ. Παρά το μικρό ποσοστό ενσωμάτωσης του [3], η λιποσωμιακή μορφή του συμπλόκου επέδειξε ισχυρότερες in vitro κυτταροτοξικές δράσεις σε σχέση με την ελεύθερη μορφή του (~25 φορές χαμηλότερη IC50 τιμή). Στις μελέτες οξείας και χρόνιας τοξικότητας δεν προκλήθηκε ο θάνατος κανενός πειραματόζωου και η ιστοπαθολογική εξέταση έδειξε πολύ ήπιες ιστικές βλάβες. Ο έλεγχος των αντικαρκινικών ιδιοτήτων ανέδειξε στατιστικά σημαντική αύξηση της επιβίωσης των καρκινοπαθών επίμυων που έφτασε στα επίπεδα του 57.45% σε σχέση με την ομάδα ελέγχου και ήταν εφάμιλλη για την μεγάλη δόση (6 x 27mg/kg ΣΒ) της ελεύθερης μορφής του συμπλόκου [3] και για τη λιποσωμιακή μορφή του συμπλόκου [3] (6 x 0.0025mg/kg ΣΒ). Ο ιστοπαθολογικός έλεγχος έδειξε ήπιες ιστικές βλάβες (ήπαρ, πνεύμονας) στην χορηγούμενη ελεύθερη μορφή του συμπλόκου ενώ η εικόνα των ιστών στη λιποσωμιακή μορφή ήταν κατά φύσιν. Με τα παραπάνω αποτελέσματα αναδεικνύεται η χρησιμότητα της ενσωμάτωσης της λιποσωμιακής νανοτεχνολογίας στην στρατηγική προσέγγισης των νέων χημείο-μέταλλο-θεραπευτικών ουσιών και η ανάδειξη των ισχυρών τους φαρμακολογικών δράσεων στη βελτίωση του αντικαρκινικού θεραπευτικού τους αποτελέσματος.