Δράση του φυτού βαλσαμόχορτο (Hypericum perforatum) στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Abstract

Aim of the current thesis is the systematic and in depth research of the anticancer activity of St John’s wort (Hypericum Perforatum) against bladder cancer. With the help of reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) hyperforin (2,36 ± 0,03 mg/g) was identified as major constituent of the aqueous extract recommended by the traditional medicine in the rural area of Epirus/ Greece. Male BULBc mice were exposed to 1000ppm OH-BBN in drinking water every other day for 6weeks. They were sacrificed after 26 weeks. The aqueous extract reachedstatistical significant anticancer effect (Fisher’s exact test p=0.048) administrated for 26 weeks after the carcinogen was induced, causing a 43,6% reduction in precancerous and cancer lesions. On the contrary concomitant administration with OH-BBN showed no statistical benefit (Fisher’s exact test p=0.093). Then we proceeded to search for the most active derivative of the plant, either as solutions or in the form of extracts or after fractionation. The components were analyzed by RP-HPLC. Anticancer activity was evaluated against T24 and NBT-II bladder cancer cell lines in the dark. The sixth Petroleum Ether Extract’s Fraction (PEE6) was the most effective. In search of the components responsible for the antitumor activity it was found that this is not due to hyperforin but unknown substances that could not be identified in the given time. TUNEL test has shown thatcell death occurs through apoptosis. From the physicochemical analysis of the extracts it was found that the Polar Methanolic Fraction (PMF), a powder containing only 0.57% hypericin, has sameemission and absorption spectra as pure hypericin, is water soluble and stable at room temperature making it an interesting photosensitizer for further study. We compared the PMF at various concentrations with Photofrin®, an FDAapproved photodynamic therapy (PDT) substance after excitation with 630 nm laser light against T24 and RT4 bladder cancer cell lines. The photosensitizer exhibited significant photocytotoxicity in both cell lines, cell destruction from 80% to 86%respectively, at a concentration of 60microg/ml and energy 4-8 J/cm2. Photofrin® exhibited photocytotocixity (77%) in the T24 cell line only. We compared white light sources for photoactivation of PMF against T24 cells. The most effective was a halogen Storz 482 Cold Light Fountain. Experimenting with female Wistar rats at various doses of intravesical PMF with staggered intravesical instillation times and various excitation energies we concluded to a dosage of 36.5mg / ml PMF, fifteen minute intravesical instillation and 700J / cm2 white light photoactivation. Based on the above, we proceeded with an experimental model of orthotopic implantation of AY27 tumor cells. We had complete (100%) elimination of superficial cancerous lesions as well as normal urothelium at 30 days’ post-treatment. Urothelium is fully regenerated, without scarring, 90 days after photodynamic therapy.In conclusion Hypericum Perforatum aqueous extract has statistical significantanticancer action when administrated after the carcinogen exposure. The antitumoractivity observed by PEE6 in vitro is attributed to substances currently unknown. PMFexhibits significant antitumor activity both in vitro, after stimulation with 630nm laserlight or white light, and in vivo, with complete elimination of the cancer lesions withoutthe appearance of scars on the bladder with fully regenerated urothelium after 90days.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η συστηματική και εις βάθος έρευνα της αντικαρκινικής δράσης του φυτού βαλσαμόχορτου γνωστού και ως Hypericim Perforatum (HP) κατά του καρκίνου της κύστης. Με την βοήθεια υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) αναγνωρίστηκε ότι το κύριο συστατικό του υδατικού διαλύματος που λαμβάνεται στα πλαίσια της παραδοσιακής ηπειρώτικης ιατρικής είναι η υπερφορίνη (2,36 ± 0,03 mg/g).Τοπειραματικό μοντέλο περιλάμβανε αρσενικά ποντίκια BULBc τα οποία εκτέθηκαν σε νιτροζαμίνη (OH-BBN) σε συγκέντρωση 1000ppm μέρα παρά μέρα για 6 εβδομάδες. Θυσιάστηκαν μετά από 26 εβδομάδες. Τα ιστολογικά δεδομένα έδειξαν ότι το υδατικό διάλυμα ασκεί στατιστικώς σημαντική αντικαρκινική δράση (Fisher’s exact test p=0.048) όταν χορηγείται για 26 εβδομάδες αφού επιδράσει ο καρκινογόνος παράγοντας. Η χορήγηση του εκχυλίσματος το διάστημα που λάμβαναν νιτροζαμίνη δεν εμφάνισε σημαντική αντικαρκινική δράση (Fisher’s exact test p=0.093). Στην συνέχεια προχωρήσαμε στην αναζήτηση του πιο δραστικού παραγώγου του φυτού, είτε με μορφή διαλυμάτων, είτε με την μορφή εκχυλισμάτων, είτε μετά από κλασματοποίηση. Η ανάλυση των συστατικών τους έγινε με RP-HPLC. Η αντικαρκινική δράση αποτιμήθηκε σε καρκινικές κυτταρικέςσειρές ουροδόχου κύστεως Τ24 και NBT-II σε συνθήκες σκότους. Η διαδικασία κλασματοποίησης ανέδειξε το έκτο κατά σειρά κλασματοποίησης κλάσμα του Εκχυλίσματος Πετρελαϊκού Αιθέρα (ΕΠΑ6) ως το πλέον δραστικό (LC50 0.17 μg/mL). Στην αναζήτηση των συστατικών που ευθύνονται για την αντικαρκινική δράση διαπιστώθηκε ότι αυτή δεν οφείλεται στην υπερφορίνη αλλά σε άγνωστες ουσίες οι οποίες δεν ήταν δυνατόν να ταυτοποιηθούν στην δεδομένη χρονική στιγμή. Ηδοκιμασία TUNEL απέδειξε πως ο κυτταρικός θάνατος επέρχεται μέσω της απόπτωσης. Από την φυσικοχημική ανάλυση των εκχυλισμάτων διαπιστώθηκε πως το Πολικό Μεθανολικό Κλάσμα (ΠΜΚ), σε μορφή πούδρας, περιέχει υπερικίνη σε συγκέντρωση 0.57% μόνο, είναι υδατοδιαλυτό, σταθερό σε θερμοκρασία δωματίου καθιστώντας το ενδιαφέρον φωτοευαισθητοποιητή για περαιτέρω μελέτη.Προχωρήσαμε σε σύγκριση του ΠΜΚ, σε διάφορες συγκεντρώσεις με το Photofrin® , εγκεκριμένη από το FDA ουσία για την Φωτοδυναμική Θεραπεία (ΦΔΘ). Το ΠΜΚ στη συγκέντρωση των 60 μg/mL, προκαλούσε κυτταρικό θάνατο στο 86% και στο 80% των Τ24 και RT4 καρκινικών κυττάρων αντίστοιχα. Το Photofrin® εμφάνισε κυτταρικό θάνατο στο 77% των Τ24 μόνο. Μετά από σύγκριση πηγών φωτισμού λευκού φωτός και ΠΜΚ σε Τ24 κύτταρα διαπιστώθηκε ότι η πιο αποτελεσματική ήταν η πηγή ψυχρού φωτισμού με λάμπα αλογόνου (Storz 482 Cold Light Fountain). Πειραματιζόμενοι με θηλυκούς Wistar αρουραίους με ποικίλες ενδοκυστικές δόσεις ΠΜΚ, με κλιμακούμενους χρόνους ενδοκυστικής παραμονής και ποικίλες ενέργειες διέγερσης καταλήξαμε στην δοσολογία των 36.5mg/ml του ΠΜΚ, δεκαπεντάλεπτη ενδοκυστική παραμόνή και διέγερση με 700J/cm2 λευκού φωτός. Με βάση το παραπάνω προχωρήσαμε σε πειραματικό μοντέλο ορθότοπης εμφύτευσης ουροθηλιακών καρκινικών κυττάρων ΑΥ27. Είχαμε πλήρη (100%) εξάλειψη επιφανειακών καρκινικών βλαβών αλλά και του φυσιολογικού ουροθηλίου στις 30 ημέρες μετά την θεραπεία. Το ουροθήλιο αναγεννάτε πλήρως, χωρίς την ύπαρξη ουλών, 90 ημέρες μετά την φωτοδυναμική θεραπεία. Συμπερασματικά το εκχύλισμα του υπέρικου, στη δοσολογία που το λάμβαναν οι ασθενείς, παρουσιάζει στατιστικώς σημαντική αντικαρκινική δράση όταν χορηγείταιμετά την δράση του καρκινογόνου. Η αντικαρκινική δράση που παρατηρείται in vitro στο αποδίδεται σε άγνωστες, προς το παρόν ουσίες, που περιέχονται στο ΕΠΑ6. Το ΠΜΚ εμφανίζει σημαντική αντικαρκινική δράση τόσο in vitro, μετά από διέγερση με λέιζερ ή λευκό φως, όσο και in vivo, με πλήρη εξάλειψη των καρκινικών λαβών, χωρίς την εμφάνιση ουλών στην ουροδόχου κύστη με πλήρως αναγεννημένο του ουροθήλιο μετά από 90 ημέρες.