Συγκριτική μελέτη μεθόδων έμμεσης ανίχνευσης αυτόλογης μετάγγισης αίματος και διέγερσης ερυθροποίησης με εντοπισμό βιοδεικτών σε βιολογικά δείγματα για τον έλεγχο ντόπινγκ αθλητών

Abstract

Despite being prohibited by the World Anti-Doping Agency (WADA), blood doping through Erythropoiesis Stimulating Agents (ESAs) misuse and blood transfusion, is used by athletes who want to gain an unfair advantage by increasing red blood cell production and hence, their aerobic capacity. Methods of direct detection can be used to detect ESAs and homologous blood transfusion in athletes’ samples. The absence of a method for the direct detection of autologous blood transfusion, the inability to detect new banned substances, and the difficulty in detecting microdoses of recombinant erythropoietins have led anti-doping science to develop methods of indirect detection. The Athlete Biological Passport (ABP), is an important achievement, as ABP is a strategy for blood doping detection through the long-term monitoring of hematological parameter levels and endogenous androgen concentrations of an individual athlete. However, new approaches to blood doping create new analytical challenges for doping control and there is a need for the enforcement of this excellent detection tool. The combination of the Athlete Biological Passport with other indirect biomarkers, such as monitoring of iron metabolism protein levels and metabolites, is believed to enhance the effectiveness of blood doping tests. The present study focused on the identification of indirect biomarkers for the detection of banned substances and/or methods included in WADA’s Prohibited List and associated with blood doping. Special attention was given to the possible effect of their abuse in erythropoiesis, the changes that may cause in the parameter of the hematological and steroid module of ABP, as well as to the estimation of iron metabolism proteins and erythropoietin expression levels. An in vivo metabolic study was performed following a single administration of 10 mg methylnortestosterone to a volunteer. Urine samples were analyzed by gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). Seven metabolites were identified (M1-M4 and S1-S3). Phase II glucuronide metabolites M2, M3, M4 and sulfate metabolites S2 and S3, were detected until the end of the excretion study (192 h), while M1 and S1 were detected for 72 h. The two glucuronide metabolites M3 and M4 and the three sulfate metabolites S1, S2, S3 are detected for the first time. It has also been observed that single administration of methylnortestosterone alters steroid profile parameters at least 48 h after administration, while not affecting urinary erythropoietin levels as shown following analysis by electrophoresis. An in vivo metabolic study was performed following a single administration of 10 mg LGD-4033 to a volunteer. Urine samples were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Six phase I metabolites M1-M6 were identified, with M5 metabolite having the largest detection window (20,5 days). The Μ5 metabolite is suggested as the most suitable biomarker for LGD-4033 detection in hydrolyzed urine samples. The M6 metabolite was detected for first time in human urine. Furthermore, after dilute-and-inject preparation of urine samples, the parent compound and the M1, M2, M3 metabolites were detected as gluco-conjugated phase II metabolites. Gluco-conjugated parent LGD-4033 can be used as a biomarker for LGD-4033 detection up to 2,5 days after administration to samples analyzed after dilution. The LGD-4033 administration did not alter steroid profile or urinary erythropoietin levels. The blood doping detection, by analyzing athletes’ blood samples for changes in the ABP hematological parameters, can be performed in the Doping Control Laboratory of Athens after the evaluation of the Sysmex XT-2000i and Sysmex XN-1000 hematological analyzers. Analysis of urine samples by LC-MS, after multiple administration of inhaled salmeterol to a volunteer at 100 μg / 12 h, demonstrated bioaccumulation of the parent substance and the α-hydroxysalmeterol metabolite, with increasing urinary concentrations up to 3,5 ng/ml for salmeterol and up to 11,11 ng/mL for its metabolite. In addition, blood samples analysis showed that salmeterol bioaccumulation may cause changes in the ABP hematological parameters and iron metabolism proteins’ level, while it also affects the urinary erythropoietin levels, as shown after analysis by electrophoresis. These results support the view that β2-adrenergic receptors are involved in the early stages of erythropoiesis in which progenitor cells do not express erythropoietin receptors.

Παρά την απαγόρευση από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Αντι-Ντόπινγκ (WADA), το ντόπινγκ αίματος, κυρίως με τη χρήση παραγόντων διέγερσης της ερυθροποίησης (ESAs) και τη μετάγγιση αίματος, χρησιμοποιείται από αθλητές που θέλουν να αποκτήσουν αθέμιτο πλεονέκτημα, αυξάνοντας την αερόβια ικανότητά τους, μέσω αύξησης της παραγωγής των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Η ομόλογη μετάγγιση αίματος και κάποιοι ESAs μπορούν να εντοπιστούν στα δείγματα των αθλητών με άμεσες μεθόδους ανίχνευσης. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει διαθέσιμη μέθοδος άμεσης ανίχνευσης της αυτόλογης μετάγγισης αίματος. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τη δυσκολία εντοπισμού νέων συνεχώς αναδυόμενων απαγορευμένων ουσιών, καθώς και τη χρήση πολλών διαφορετικών ανασυνδυασμένων ερυθροποιητινών σε μικροδόσεις, οδήγησε την επιστήμη του αντι-ντόπινγκ στην ανάπτυξη μεθόδων έμμεσης ανίχνευσης. Το Βιολογικό Διαβατήριο Αθλητή (ABP), ως στρατηγική για την έμμεση ανίχνευση ντόπινγκ αίματος μέσω της διαχρονικής παρακολούθησης των επιπέδων των αιματολογικών παραμέτρων και των ενδογενών στεροειδών σε ατομικό επίπεδο, αποτελεί σημαντική κατάκτηση. Νέες προσεγγίσεις, όμως, στο ντόπινγκ αίματος δημιουργούν νέες αναλυτικές προκλήσεις και ως εκ τούτου δημιουργείται η ανάγκη για περαιτέρω ενίσχυση αυτού του εργαλείου. Ο συνδυασμός του ABP με άλλους έμμεσους βιοδείκτες ανίχνευσης, όπως το προφίλ σιδήρου και οι μεταβολίτες, εκτιμάται ότι θα ενισχύσει την αποτελεσματικότητα των ελέγχων ντόπινγκ αίματος. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην αναζήτηση βιοδεικτών έμμεσης ανίχνευσης απαγορευμένων ουσιών ή/και μεθόδων από τον Κατάλογο Απαγορευμένων Ουσιών του WADA που μπορούν να συσχετιστούν με το ντόπινγκ αίματος. Ιδιαίτερη σημασία δόθηκε στη μελέτη της πιθανής επίδρασης της χρήσης των ουσιών ή/και των μεθόδων αυτών στη διαδικασία της ερυθροποίησης, καθώς και στη μελέτη των μεταβολών που μπορεί να προκαλέσει η χρήση τους στις παραμέτρους του ΑBP, κυρίως της αιματολογικής, αλλά και της στεροειδούς ενότητας, καθώς και στο προφίλ σιδήρου και στα επίπεδα έκφρασης της ερυθροποιητίνης. In vivo μεταβολική μελέτη πραγματοποιήθηκε μετά από απλή χορήγηση 10 mg μεθυλονορτεστοστερόνης σε εθελοντή. Τα δείγματα ούρων αναλύθηκαν με αεριοχρωματογραφία συνδεδεμένη με διπλή φασματομετρία μαζών (GC-MS/MS), οδηγώντας στην ταυτοποίηση επτά μεταβολιτών (Μ1-Μ4 και S1-S3). Οι μεταβολίτες φάσης ΙΙ Μ2, Μ3, Μ4 και S2, S3 της μεθυλονορτεστοστερόνης ανιχνεύθηκαν μέχρι το τέλος της μελέτης απέκκρισης (192 h), ενώ οι Μ1, S1 ανιχνεύθηκαν για 72 h. Οι δύο συζευγμένοι με γλυκουρονικό οξύ μεταβολίτες Μ3 και Μ4 και οι τρεις συζευγμένοι με θειικό οξύ μεταβολίτες S1, S2 και S3 ανιχνεύονται για πρώτη φορά. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι η απλή χορήγηση μεθυλονορτεστοστερόνης μεταβάλει τις παραμέτρους του προφίλ των στεροειδών τουλάχιστον για 48 h μετά τη χορήγηση, ενώ δεν επηρεάζει τα επίπεδα της ερυθροποιητίνης στα ούρα, μετά από ανάλυσή τους με ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. In vivo μεταβολική μελέτη πραγματοποιήθηκε μετά από απλή χορήγηση 10 mg LGD-4033 σε εθελοντή. Τα δείγματα ούρων αναλύθηκαν με υγροχρωματογραφία συνδεδεμένη με φασματομετρία μαζών (LC-MS). Εντοπίστηκαν έξι μεταβολίτες φάσης Ι Μ1-Μ6, με τον Μ5 να έχει το μεγαλύτερο παράθυρο ανίχνευσης (20,5 ημέρες) αποτελώντας το βασικό βιοδείκτη ελέγχου κατάχρησης LGD-4033 σε δείγματα ούρων που έχουν υποστεί υδρόλυση. Ο Μ6 ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά σε ανθρώπινα ούρα. Ακόμη, μετά από απλή αραίωση των δειγμάτων ούρων η μητρική ουσία και οι Μ1, Μ2, Μ3 ανιχνεύτηκαν ως μεταβολίτες φάσης ΙΙ συζευγμένοι με γλυκουρονικό οξύ. Το γλυκουρονίδιο του LGD-4033 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για την ανίχνευση της ουσίας έως και 2,5 ημέρες μετά τη χορήγηση σε δείγματα που αναλύονται μετά από απλή αραίωσή τους. Η απλή χορήγηση LGD-4033 δεν προκάλεσε μεταβολές στο προφίλ των στεροειδών, ούτε στα επίπεδα έκφρασης της ερυθροποιητίνης στα ούρα. Η ανίχνευση ντόπινγκ αίματος, με έλεγχο δειγμάτων αίματος αθλητών για μεταβολές στις αιματολογικές παραμέτρους του ABP, μπορεί να πραγματοποιηθεί από το Εργαστήριο Ελέγχου Ντόπινγκ της Αθήνας μετά από επικύρωση της λειτουργίας και έλεγχο της ορθότητας των μετρήσεων των αιματολογικών αναλυτών Sysmex XT-2000i και Sysmex XN-1000. H ανάλυση δειγμάτων ούρων με LC-MS μετά την πολλαπλή χορήγηση εισπνεόμενης σαλμετερόλης σε εθελοντή με 100 μg / 12 h απέδειξε τη βιοσυσσώρευση της μητρικής ουσίας και του μεταβολίτη της α-υδροξυσαλμετερόλη, με αυξανόμενες συγκεντρώσεις στα ούρα που φτάνουν μέχρι τα 3,53 ng/mL για τη σαλμετερόλη και τα 11,11 ng/mL για τον μεταβολίτη της. Επιπλέον, η ανάλυση των δειγμάτων αίματος της μελέτης έδειξε ότι η βιοσυσσώρευση σαλμετερόλης μπορεί να προκαλέσει μεταβολές στις αιματολογικές παραμέτρους του ABP και στο προφίλ σιδήρου, ενώ επηρεάζει και τα επίπεδα της ερυθροποιητίνης στα ούρα, μετά από ανάλυσή τους με ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν την άποψη ότι οι β2-αδρενεργικοί υποδοχείς συμμετέχουν στα πρώτα στάδια της ερυθροποίησης κατά τα οποία τα προγονικά κύτταρα δεν φέρουν υποδοχείς ερυθροποιητίνης.