Χημικοί περιβαλλοντικοί παράγοντες και κυτταρική απάντηση: φαρμακολογική και επιγενετική προσέγγιση

Abstract

Although tributyltin (TBT) is a widespread environmental pollutant, its effects at the cellular level has not been adequately studied. The unicellular eukaryote S. cerevisiae is considered as a appropriate model organism for the study of the effects of TBT on eukaryotic cells. The aim of this study was to investigate the effects of TBT on the growth, proliferation, survival, morphology and metabolic profile of S. cerevisiae as well as the development of potential epigenetic alterations and/or adaptive mechanisms after TBT exposure. Ultimately, this study sought to explore the putative interactions of TBT with the biological processes in eukaryotic cells and organisms. The experimental approach included single and/or repeated administration of different TBT dosages (5.0-31.5 μM) in asynchronous cultures of S. cerevisiae ATCC 2366 during the lag, logarithmic and/or stationery phase of growth. The yeast response was evaluated under the optical microscope, mainly by determining the total cell number, the proportion of the budded and living cells and any morphological changes, while the metabolic profile was investigated by the spectrophotometric determination of carbohydrates using the anthrone method. The results showed a dose-dependent inhibition of growth, survival and proliferation of yeast cells upon TBT administration during the lag and the logarithmic phase. No effect was observed during administration at the stationery phase. Interestingly, shortly after exposure to TBT, live aberrant cells appeared, characterized by large cytoplasmic structures that referred to vacuoles. Also, the increase of glycogen and trehalose levels at the post-logaritmic phase of growth of cells exposed to TBT, were indicative of the selective action of the compound on the growth rate of yeast. Yet, the determination of the kinetic characteristics of TBT actions remain elusive. The obtained data provided evidence for the inhibitory action of TBT, mainly on the rapidly proliferating cells, where V ATPase inhibition likely prevented vacuole acidification and lead to cell cycle arrest. The effect of TBT was cumulative and the cellular subpopulation that survived was capable to proliferate and to overcome the toxic effects of TBT at the post-logarithmic phase of growth. Finally, in the S. cerevisiae strain used in this study, TBT did not seem to cause any epigenetic alterations associated with “petite” mutations. Interestingly, the preliminary findings related to the development of the potentially protective cellular stress response during chronic exposure of yeast to subtoxic TBT concentrations deserve further consideration.

Ο τριβουτυλοκασσίτερος (ΤΒΤ) είναι ένας διαδεδομένος περιβαλλοντικός ρυπαντής, αλλά ως ουσία με πιθανή φαρμακολογική δράση δεν έχει μελετηθεί επαρκώς. Ο μονοκύτταρος οργανισμός Saccharomyces cerevisiae επιλέχθηκε ως κατάλληλο πειραματικό πρότυπο για την μελέτη της επίδρασης του ΤΒΤ στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Σκοπός της εργασίας ήταν η διερεύνηση της επίδρασης του ΤΒΤ στην ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, τη μορφολογία και το μεταβολικό προφίλ του S. cerevisiae, και η διερεύνηση πιθανής ανάπτυξης επιγενετικών και προσαρμοστικών κατά την έκθεση στην υπό μελέτη ουσία, με στόχο την αποσαφήνιση των επιδράσεων και αλληλεπιδράσεων του ΤΒΤ με τις βιολογικές διεργασίες των ευκαρυωτικών κυττάρων και οργανισμών. Η πειραματική προσέγγιση αφορούσε εφάπαξ ή/και επαναλαμβανόμενη χορήγηση διαφόρων δοσολογικών σχημάτων ΤΒΤ (5-31,5 μΜ) σε ασύγχρονες καλλιέργειες του S. cerevisiae ATCC 2366 κατά τη λανθάνουσα, λογαριθμική και/ή στάσιμη φάση της ανάπτυξης. Η απάντηση του σακχαρομύκητα αξιολογήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο, κυρίως μέσω προσδιορισμού του συνολικού αριθμού και της αναλογίας των διαιρούμενων και των ζωντανών κυττάρων του σακχαρομύκητα, και περιγραφής τυχόν μορφολογικών μεταβολών, ενώ το μεταβολικό προφίλ αξιολογήθηκε με τον φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό με τη μέθοδο της ανθρόνης των επιπέδων γλυκόζης, τρεαλόζης και γλυκογόνου στις καλλιέργειες. Τα αποτελέσματα έδειξαν δοσοεξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης, της επιβίωσης και του πολλαπλασιασμού του σακχαρομύκητα κατά τη χορήγηση ΤΒΤ στη λανθάνουσα και τη λογαριθμική φάση, ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή στη στάσιμη φάση. Κατά την έκθεση στον ΤΒΤ, αξιοσημείωτη ήταν η άμεση και παροδική εμφάνιση ζωντανών άτυπων κυττάρων που χαρακτηρίζονταν από ευδιάκριτες κυτταροπλασματικές δομές μεγάλου μεγέθους που παρέπεμπαν σε κενοτόπια. Επίσης, η αύξηση των επιπέδων γλυκογόνου και τρεαλόζης στη μεταλογαριθμική φάση της ανάπτυξης των πληθυσμών που είχαν εκτεθεί στον ΤΒΤ υποστηρίζουν την εκλεκτική επίδραση της ουσίας στον ρυθμό ανάπτυξης του σακχαρομύκητα, χωρίς ωστόσο να είναι εφικτός, προς το παρόν, ο προσδιορισμός των κινητικών χαρακτηριστικών των δράσεων του ΤΒΤ. Τα δεδομένα παρείχαν ενδείξεις υπέρ της ανασταλτικής επίδρασης του ΤΒΤ κυρίως στα ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, όπου, πιθανώς, η αναστολή της V ATPάσης εμπόδισε την οξίνιση του κενοτοπίου και, τελικά, οδήγησε στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Η δράση του ΤΒΤ ήταν συσσωρευτική, ενώ ο κυτταρικός υποπληθυσμός που επιβίωσε διατήρησε την ικανότητα πολλαπλασιασμού και τελικά ξεπέρασε την τοξική επίδραση του ΤΒΤ έως τη μεταλογαριθμική φάση της ανάπτυξης. Τέλος, ο ΤΒΤ δεν προκάλεσε επιγενετικές αλλοιώσεις στον σακχαρομύκητα που σχετίζονται με μεταλλάξεις petite, ενώ ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασαν τα πιλοτικά ευρήματα που υποστηρίζουν την κινητοποίηση εν δυνάμει προστατευτικών μηχανισμών κυτταρικού stress κατά τη χρόνια έκθεση του σακχαρομύκητα σε υποτοξικές συγκεντρώσεις ΤΒΤ.