Ανοσοαιματολογική διερεύνηση ασθενών και αιμοδοτών (με ορολογικές και μοριακές μεθόδους)

Abstract

ABO system along with the Rhesus system is the most diverse and immunogenic system of blood groups and the most important in transfusion therapy. Although most people are categorized in four ABO blood group the existence of subgroups complicate the transfusion. Respectively besides of RhD positive and RhD negative, there is a percentage of variant D antigen, that belong to those categories and carry the weak D, partial D and DEL phenotypes. Blood typing should take into account all expressions of the RhD antigen in order to avoid anti-D alloimmunization. The aim of the study was to determine the frequency of ABO subgroups and variants of the Rhesus system, detect those polymorphisms in Greek population, clinical management and final characterization of these samples. For this purpose, two molecular methods, PCR-SSP and PCR-BeadChip, used to detect RHD gene variants. Results: Of the 86 samples, 40 samples were tester for ABO molecular typing and 46 for RhD over a 3-year period. Of these, 40 samples were formulated as ΑΒΟ*A2B= 7(17,5%), subgroup AB: 3 (7,5%), ΑΒΟ*Ο/Α= 7 (17,5%), ΑΒΟ*Ο/Α2= 3 (7,5%), ΑΒΟ*Ο/ΑW(06,07,13) = 10 (25%), ΑΒΟ*Α/ΑW06= 4 (10%), ΑΒΟ*O/B= 2 (5%), ΑΒΟ*Ο/Β3=1 (2,5%), ΑΒΟ*O/O2= 2 (5%), ΑΒΟ*O/Ο45=1 (2,5%). In the second part of these study 46 samples of genomic DNA were tested for RhD, 70% of them were classified as D weak and their frequency were: RHD * weak D type 1 (n = 22), 47.8%, RHD * weak D type 3 (n = 3) 6.5%, RHD * weak D type 5 (n = 6) 13%, RHD * weak D type 11 (n = 4) 8.7%. RHD * weak D type 2 and RHD * weak D type 15 are represented once (2.2%). 5 types of D partial were detected: RHD * partial DV type 1 was detected in 3 blood donors (6.5%), whereas RHD * partial DIV, RHD * partial DVII, RHD * DAR 1.1 / type 4.2.1, RHD * type DAR 3.1 / type 4.0 were standardized once (2.2% incidence). Both molecular methods failed to characterize 2 samples, those were sequenced by the Sanger method. In conclusion, the molecular assay of the ABO blood group system and the Rhesus CDE system is a valuable complementary method for prenatal testing and not an alternative to traditional prenatal testing methods because the molecular methods are not completely robust due to the generation of new mutations. The clinical significance of these changes is that D weak individuals belonging to types 1, 2, 3, 4.0, 4.1 and 5 can be treated as Rhesus D (+) and transfused with Rhesus D (+) red blood cells, while people with D type 4.2 to 11 and 15 should be treated as Rhesus D (-) and transfused with Rhesus D (-) red blood cells. D partial can produce a different epitope of the protein and therefore induce specific antibody production if transfected into Rhesus D negative patient. An RHD genotyping strategy, which will detect D-variants with an immunoassay and confirm D-negative blood donors with clinically significant alleles, could effectively enhance routine serological testing in Blood Donation. Finally, valuable RhD negative blood units could be saved if patients with specific RHD genotypes are transfused as RhD positive.

Το σύστημα ABO μαζί με το σύστημα Rhesus είναι το πιο ποικίλο και ανοσογόνο σύστημα ομάδων αίματος και το πιο σημαντικό στη θεραπεία μετάγγισης. Αν και οι περισσότεροι άνθρωποι κατηγοριοποιούνται σε τέσσερις ομάδες αίματος ABO, η ύπαρξη υποομάδων περιπλέκει τη μετάγγιση. Αντίστοιχα, εκτός από το RhD θετικό και το RhD αρνητικό, υπάρχει ένα ποσοστό που φέρει παραλλαγές του D αντιγόνου, και διαχωρίζεται στις κατηγορίες weak D, partial D και DEL φαινοτύπους. Η τυποποίηση των αιμοδοτών πρέπει να λαμβάνει υπόψιν όλες τις εκφράσεις του RhD αντιγόνου προκειμένου να αποφευχθεί η αντι-D αλλοανοσοποίηση. Ο σκοπός της μελέτης ήταν να προσδιορίσει τη συχνότητα των υποομάδων ABO και παραλλαγών του συστήματος Rhesus, να ανιχνεύσει αυτούς τους πολυμορφισμούς στον ελληνικό πληθυσμό, την κλινική διαχείριση και τελικό χαρακτηρισμό αυτών των δειγμάτων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR-SSP και PCR-BeadChip προκειμένου να ανιχνεύσουν τις ποικιλίες του γονιδίου RHD. Αποτελέσματα: Από τα 86 δείγματα, 40 για ΑΒΟ διερεύνηση και 46 για RhD οι οποίοι ελέγχθηκαν σε χρονικό διάστημα 3 ετών, γονοτυπήθηκαν με την εμπορική μέθοδο PCR-SSP. Από αυτά, τα 40 δείγματα τυποποιήθηκαν ως ΑΒΟ*A2B= 7(17,5%), Yποομάδα AB: 3 (7,5%), ΑΒΟ*Ο/Α= 7 (17,5%), ΑΒΟ*Ο/Α2= 3 (7,5%), ΑΒΟ*Ο/ΑW(06,07,13) = 10 (25%), ΑΒΟ*Α/ΑW06= 4 (10%), ΑΒΟ*O/B= 2 (5%), ΑΒΟ*Ο/Β3=1 (2,5%), ΑΒΟ*O/O2= 2 (5%), ΑΒΟ*O/Ο45=1 (2,5%). Στο δεύτερο σκέλος της μελέτης ελέγχθηκαν 46 δείγματα γενωμικού DNA, το 70% αυτών χαρακτηρίστηκαν ως D weak και καταγράφηκαν τέσσερις διαφορετικοί D weak στον Ελληνικό πληθυσμό και η συχνότητά τους ήταν: RHD*weak D type 1 (n = 22), 47,8%, RHD*weak D type 3 (n =3 ) 6,5%, RHD*weak D type 5(n=6) 13%, RHD*weak D type 11 (n = 4) 8,7%. ο RHD*weak D type 2 και RHD*weak D type 15 εκπροσωπούνται από μία φορά (2,2%). Ανιχνεύτηκαν 5 τύποι D partial: RHD*partial DV type 1 παρατηρήθηκε σε 3 αιμοδότες (6,5%), ενώ RHD*partial DIV, RHD*partial DVII, RHD* DAR 1.1/type 4.2.1, RHD* type DAR 3.1/ type 4.0 τυποποιήθηκαν από μία φορά (2,2% συχνότητα εμφάνισης). Οι δύο μέθοδοι απέτυχαν να τυποποιήσουν 2 δείγματα, αυτά αναλύθηκαν με την μέθοδο Sanger. Συμπερασματικά, ο μοριακός προσδιορισμός του ΑΒΟ συστήματος ομάδας αίματος και του συστήματος Rhesus CDE, αποτελεί μια πολύτιμη συμπληρωματική μέθοδο προμεταγγισιακού ελέγχου και όχι εναλλακτική λύση στις παραδοσιακές μεθόδους προμεταγγισιακού ελέγχου διότι οι μοριακές μέθοδοι δεν είναι εντελώς ισχυρές, λόγω των νέων μεταλλάξεων που προκύπτουν συνεχώς. Η κλινική σημασία αυτών των αλλαγών είναι, ότι τα D weak άτομα που ανήκουν στους τύπους 1, 2, 3, 4.0, 4.1 και 5 μπορούν να αντιμετωπίζονται ως Rhesus D (+) και να μεταγγισθούν με Rhesus D (+) ερυθρά αιμοσφαίρια, ενώ άτομα με D weak τύπο 4.2 έως 11 και 15 θα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως Rhesus D (-) και να μεταγγίζονται με Rhesus D (-) ερυθρά αιμοσφαίρια. Τα D partial μπορούν να παράγουν μια διαφορετική ως προς τις επιτόπους πρωτεΐνη και, ως εκ τούτου, να επάγουν παραγωγή ειδικού αντισώματος, αν μεταγγισθούν σε Rhesus D αρνητικό ασθενή. Μια στρατηγική γονοτύπησης του RHD, η οποία θα ανιχνεύει τις ποικιλίες του D με ικανότητα αλλοανοσοποίησης και θα επιβεβαιώνει τους D αρνητικούς αιμοδότες με κλινικώς σημαντικά αλληλόμορφα, θα μπορούσε να ενισχύσει αποτελεσματικά τον ορολογικό έλεγχο ρουτίνας στην Αιμοδοσία. Τέλος, πολύτιμοι RhD αρνητικοί ασκοί αίματος θα μπορούσαν να εξοικονομηθούν αν ασθενείς οι οποίοι διαθέτουν συγκεκριμένους γονότυπους RHD μεταγγίζονται ως RhD θετικοί.