Μελέτη του ρόλου της κυτταροκίνης RANKL σε οστεοανοσολογικές αλληλεπιδράσεις με διαγονιδιακά ζωικά μοντέλα οστικής απώλειας

Abstract

Receptor Αctivator of Νuclear factor Κappa-B Ligand (RANKL), a member of the Tumor Necrosis Factor (TNF) superfamily, constitutes the master regulator of osteoclast formation and bone resorption. RANKL binds and activates its receptor, RANK, and consequently induces the differentiation, maturation and survival of osteoclasts, which are the main cells responsible for bone resorption. In humans, functional mutations in the RANKL gene cause Autosomal Recessive Osteopetrosis (ARO), whereas overproduction of RANKL is accociated with a plethora of bone degenerative pathologies, such as osteoporosis and rheumatoid arthritis. Targeted inhibition of RANKL by administration of a monoclonal antibody (Denosumab, Dmab) effectively reduces the increased rate of fractures observed in menopausal women, constituting the new treatment for osteoporosis. Moreover, it is known that RANKL significantly affects the maturation and activation of the immune system since knockout mice that cannot produce RANKL, display severe osteopetrosis due to the absence of osteoclasts, but also thymic hypoplasia, absence of lymph nodes and a decrease in B lymphocytes. However, it remains unclear whether adundant RANKL affects leukocyte populations in lymphoid organs, as well as inflammatory bone diseases, such as rheumatoid arthritis. Dr Eleni’s Douni research group has generated in the past, two transgenic models of osteoporosis that overproduce the human RANKL (huRANKL) protein (TgRANKL) through genetic engineering. Tg5516 transgenic mice expressing low levels of huRANKL develop mild osteoporosis, whereas, Tg5519 transgenic mice overexpress huRANKL and display severe osteoporosis. Moreover, the same group has also generated RANKLtles/tles mice, which display severe osteopetrosis, due to a functional mutation in the Rankl gene. These animal models, consist excellent tools to investigate the role of RANKL in the immune system and in inflammatory diseases. In the present PhD thesis, we investigated a) whether overexpression of RANKL in osteoporotic TgRANKL mice affects leukocyte maturation in primary and secondary lymphoid organs in order to understand the osteoimmunological interactions that take place under osteoporotic conditions, b) the role of RANKL in inflammatory arthritis by inactivating or overexpressing RANKL in the TNF-mediated Tg197 transgenic mouse model of arthritis, and c) the protein profile of Tg197/TgRANKL double transgenic mice that overexpress TNF and RANKL compared with the protein profile of the Tg197 arthritic and Tg5519 osteoporotic littermates, in order to study the pathogenetic mechanisms induced by overexpression of RANKL in inflammatory diseases.Analysis of lymphoid organs with flow cytometry showed significant differences between Tg5519 and WT mice. Specifically, bone marrow (BM) analysis of Tg5519 mice revealed a progressive reduction of leukocyte numbers at the age of 6 months, due to the increased adipogenesis that takes place in BM impairing hematopoiesis. Moreover, a selective increase in the percentage of B lymphocytes was also identified, indicating an acceleration in B lymphocyte maturation process. In thymus, although there were no differences in the total number of thymocytes, the immature double positive CD4+CD8+ cell population was significantly reduced while mature CD4+ and CD8+ populations increased, indicating an accelerated T cell differentiation process in Tg5519 mice. Analysis of spleen showed a significant decrease in leukocytes at 8 months of age, as a result of reduced BM hematopoiesis. However, at younger ages Tg5519 mice showed a significant increase in the B lymphocyte population, which is consistent with the analysis of BM. Peripheral blood also showed a significant decrease in leukocytes at 8 months. A similar analysis at 6 months of age in Tg5516 transgenic mice showed no significant differences in leukocytes of lymphoid organs compared to WT mice, probably reflecting the restricted bone marrow adiposity in the Tg5516 line.At the second part of our results, we used the human TNF transgenic mouse model of erosive inammatory arthritis, Tg197, to determine if the progression of inammation is affected by either genetic inactivation or overexpression of RANKL in transgenic mouse models. TNF-mediated inammatory arthritis was signicantly attenuated in the absence of functional RANKL. Our results also demonstated that RANKL is necessary for physiological bone remodeling and inflammation-induced bone destruction. Notably, TNF overexpression could not compensate for RANKL-mediated osteopetrosis, but promoted limited osteoclastogenesis between the pannus and bone interface, suggesting RANKL-independent mechanisms of osteoclastogenesis in inamed joints. On the other hand, simultaneous overexpression of RANKL and TNF in double transgenic mice accelerated disease onset and led to severe arthritis characterized by signicantly elevated clinical and histological scores as shown by aggressive pannus formation, extended bone resorption, and massive accumulation of inammatory cells, mainly of myeloid origin. RANKL and TNF cooperated not only in local bone loss identied in the inamed calcaneous bone, but also systemically in distal femurs as shown by microCT analysis. Proteomic analysis in inamed ankles from double transgenic mice overexpressing human TNF and RANKL showed an abundance of proteins involved in osteoclastogenesis, pro-inammatory processes, gene expression regulation, and cell proliferation compared to Tg197 and Tg5519 single transgenic mice. Collectively, these results suggest that RANKL modulates modeled inammatory arthritis not only as a mediator of osteoclastogenesis and bone resorption but also as a disease modier affecting inammation and immune activation. In conclusion, our study suggests that a dual inhibition of RANKL and TNF could be a more effective treatment in RA than existing ones, as it would simultaneously target both inflammation and bone destruction.

Ο προσδέτης του υποδοχέα ενεργοποίησης του πυρηνικού παράγoντα-κΒ (Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand, RANKL), ανήκει στην TNF υπερ-οικογένεια και συνιστά τον κύριο ρυθμιστή της οστικής απώλειας. Η πρωτείνη RANKL προσδένεται και ενεργοποιεί τον υποδοχέα RANK, επάγοντας την διαφοροποίηση, ωρίμανση και επιβίωση των οστεοκλαστών, κυττάρων που ευθύνονται για την οστική απορρόφηση. Στον άνθρωπο, λειτουργικές μεταλλάξεις στο γονίδιο RANKL προκαλούν αυτοσωμική υπολειπόμενη οστεοπέτρωση (Autosomal Recessive Osteopetrosis, ARO) λόγω απουσίας οστεοκλαστών, ενώ η υπερέκφραση του RANKL εμπλέκεται σε μία πληθώρα από οστεοεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η οστεοπόρωση και η ρευματοειδής αρθρίτιδα. Η στοχευμένη αναστολή της πρωτεΐνης RANKL, μέσω χορήγησης ενός μονοκλωνικού αντισώματος έναντι αυτής, του denosumab, μειώνει αποτελεσματικά το αυξημένο ποσοστό καταγμάτων που παρατηρείται στις εμμηνοπαυσιακές γυναίκες, αποτελώντας τη νέα θεραπευτική αντιμετώπιση της οστεοπόρωσης. Επίσης, έχει δειχθεί ότι η πρωτεΐνη RANKL επηρεάζει σημαντικά την ωρίμανση και ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος αφού ποντίκια ελλειματικά για το γονίδιο Rankl (Rankl KO mice) εκτός από οστεοπέτρωση εμφανίζουν υποπλασία στον θύμο, απουσία των λεμφαδένων και μείωση στον πληθυσμό των Β λεμφοκυττάρων. Ωστόσο, παραμένει ασαφές εάν η περίσσεια της πρωτεΐνης RANKL επηρεάζει τους πληθυσμούς των λεμφικών οργάνων αλλά και τις φλεγμονώδεις ασθένειες των οστών, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα.Η ερευνητική ομάδα της Δρ Ε. Ντούνη, έχει δημιουργήσει στο παρελθόν δύο διαγονιδιακά πρότυπα οστεοπόρωσης (TgRANKL) που υπερπαράγουν την ανθρώπινη RANKL (huRANKL) πρωτεΐνη, το Tg5516 και το Tg5519, χρησιμοποιώντας μεθόδους γενετικής μηχανικής. Το πρώτο αποτελεί πρότυπο ήπιας οστεοπόρωσης, ενώ το το δεύτερο πρότυπο σοβαρής οστεοπόρωσης, παράγοντας την πρωτεΐνη RANKL σε χαμηλά ή σε υψηλά επίπεδα, αντίστοιχα. Η ίδια ομάδα έχει επίσης δημιουργήσει με τυχαία μεταλλαξογένεση ποντίκια τα οποία φέρουν μία λειτουργική μετάλλαξη στο γονίδιο Rankl και αποτελούν πρότυπο οστεοπέτρωσης (RANKLtles/tles). Τα ζωικά αυτά πρότυπα, αποτελούν άριστα εργαλεία για να διερευνηθεί ο ρόλος της πρωτεΐνης RANKL στο ανοσοποιητικό σύστημα αλλά και σε φλεγμονώδεις ασθένειες.Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής μελετήθηκε: α) εάν η υπερέκφραση του Rankl γονιδίου επηρεάζει την ωρίμανση των λευκοκυττάρων στα πρωτογενή και δευτερογενή λεμφικά όργανα, με σκοπό την κατανόηση των οστεοανοσολογικών αλληλεπιδράσεων σε συνθήκες οστεοπόρωσης, με τη χρήση των προτύπων οστεοπόρωσης (TgRANKL ποντίκια : Tg5519 και Τg5516),β) ο ρόλος της πρωτεΐνης RANKL στην φλεγμονώδη αρθρίτιδα, όπου με κατάλληλες διασταυρώσεις, επιτεύχθηκε η απενεργοποίηση του Rankl (RANKLtles/tles) ή η υπερέκφραση του huRANKL (TgRANKL) στο ΤΝF-εξαρτώμενο διαγονιδιακό πρότυπο αρθρίτιδας (TghuTNF, διαγονιδιακή σειρά ποντικιών Τg197) μελετώντας τους απογόνους (Τg197/ RANKLtles/tles, Tg197/Tg5516, Tg197/Tg5519) και τα αντίστοιχα ποντίκια ελέγχου, σε κλινικό, ιστοπαθολογικό, ανοσολογικό και οστικό επίπεδο, γ) το πρωτεϊνικό προφίλ της αρθρίτιδας που εμφανίζεται σε ποντίκια της ίδιας τοκετομάδας που υπερεκφράζουν huTNF και huRANKL (διπλά διαγονιδιακά, Tg197/Tg5519) σε σχέση με τα αρθριτικά που υπερεκφράζουν μόνο huTNF (Τg197) αλλά και τα οστεοπορωτικά που εκφράζουν μόνο huRANKL (Τg5519), προκειμένου να διερευνηθούν οι παθογενετικοί μηχανισμοί που επάγονται μέσω της υπερέκφρασης του Rankl σε φλεγμονώδεις ασθένειες.Η ανάλυση των λεμφικών οργάνων (μυελός των οστών, θύμος, σπλήνα και περιφερικό αίμα) με κυτταρομετρία ροής έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ των Τg5519 και των αγρίου τύπου (Wild Type, WT) ποντικιών. Συγκεκριμένα, η ανάλυση του μυελού των οστών στα Τg5519 ποντίκια έδειξε μια σταδιακή μείωση του αριθμού των λευκοκυττάρων από τον 6o μήνα, εξαιτίας της αυξημένης λιπογένεσης στο μυελό των οστών που περιορίζει την αιμοποίηση. Επίσης, παρατηρήθηκε μια επιλεκτική αύξηση του ποσοστού των B λεμφοκυττάρων, υποδεικνύοντας μια πιθανή επιτάχυνση στην ωρίμανση τους. Στο θύμο, αν και δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στον συνολικό αριθμό των θυμοκυττάρων, ωστόσο ο πληθυσμός των ανώριμων διπλών θετικών CD4+CD8+ κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένος, ενώ οι πληθυσμοί των ώριμων CD4+ και CD8+ ήταν αυξημένοι, κάτι που μπορεί να οφείλεται σε επιτάχυνση της διαδικασίας διαφοροποίησης των Τ λεμφοκυττάρων στα Tg5519 ποντίκια. Η ανάλυση του σπλήνα έδειξε σημαντική μείωση των λευκοκυττάρων στην ηλικία των 8 μηνών, ως αποτέλεσμα της μειωμένης αιμοποίησης στον μυελό των οστών. Ωστόσο, σε νεότερες ηλικίες τα Tg5519 ποντίκια παρουσιάζουν μια σημαντική αύξηση στον πληθυσμό των Β λεμφοκυττάρων στον σπλήνα, κάτι που συμφωνεί με την ανάλυση του μυελού των οστών. Στο περιφερικό αίμα παρατηρείται επίσης σημαντική μείωση των λευκοκυττάρων στους 8 μήνες. Όσον αφορά την ανοσολογική ανάλυση της διαγονιδιακής σειράς Tg5516, αντίστοιχη ανάλυση με της διαγονιδιακής σειράς Tg5519 στην ηλικία των 6 μηνών, δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στα λευκοκύτταρα των λεμφικών ιστών σε σχέση με τα ποντίκια αγρίου τύπου, κάτι που σχετίζεται με την μικρότερη έκταση λιπογένεσης στον μυελό των οστών των Tg5516 ποντικιών. Στο δεύτερο μέρος των μελετών εξετάστηκε αν η εκφυλιστική πρόοδος της TNF-εξαρτώμενης φλεγμονώδους αρθρίτιδας, επηρεάζεται από την γενετική απενεργοποίηση ή υπερέκφραση του Rankl. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική ύφεση της αρθρίτιδας στο TghuTNF ποντίκι απουσία λειτουργικής RANKL πρωτεΐνης, μέσω διασταυρώσεων με τα οστεοπετρωτικά ποντίκια (TghuTNF/ RANKLtles/tles), τόσο σε κλινικό επίπεδο με την δραματική μείωση των κλινικών συμπτωμάτων της αρθρίτιδας, όσο και ιστοπαθολογικά με την σημαντική μείωση της υπερπλασίας του αρθρικού υμένα και της φλεγμονής. Επιπλέον, μολονότι φάνηκε ότι η πρωτεΐνη RANKL είναι απαραίτητη για την φυσιολογική οστική αναδόμηση αλλά και την οστική καταστροφή που επάγεται από την φλεγμονή, η υπερέκφραση του huTNF δεν διέσωσε τον RANKL-εξαρτώμενο οστεοπετρωτικό φαινότυπο, προώθησε όμως τη δημιουργία περιορισμένων οστεοκλαστών στα σημεία επαφής οστού και φλεγμονής. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν την ύπαρξη in vivo RANKL-ανεξάρτητων μηχανισμών οστεοκλαστογένεσης στις φλεγμονώδεις αρθρώσεις. Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση huRANKL σε φλεγμονώδη TNF-εξαρτώμενη αρθρίτιδα, σε ποντίκια Τg197/Tg5519 ή Τg5516, επιτάχυνε την έναρξη της αρθρίτιδας και επιδείνωσε τον αρθριτικό φαινότυπο όπως αποδείχθηκε από εκτεταμένη υπερπλασία του αρθρικού υμένα, αύξηση του οστικού εκφυλισμού, και μαζική συσσώρευση φλεγμονωδών κυττάρων, κυρίως της μυελικής σειράς σε σύγκριση με την εμφάνιση της νόσου στα TghuTNF ποντίκια. Η ανάλυση των οστών με microCT έδειξε επίσης ότι RANKL και TNF δρουν συνεργιστικά στην οστική καταστροφή, όχι μόνο τοπικά στην περιοχή της φλεγμονώδους ποδοκνημικής άρθρωσης αλλά και συστημικά στα μηριαία οστά. H πρωτεομική ανάλυση στις φλεγμονώδεις αρθρώσεις των Tg197/Tg5519 ποντικιών με φασματομετρία μάζας έδειξε εμπλουτισμό για πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην οστεοκλαστογένεση, σε προφλεγμονώδεις διεργασίες, στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, σε σχέση αυτές με των ποντικιών ελέγχου Tg197 και Τg5519. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η πρωτεΐνη RANKL τροποποιεί την TNF-εξαρτώμενη φλεγμονώδη αρθρίτιδα στο Tg197 πρότυπο, όχι μόνο προωθώντας την οστεοκλαστογένεση και την οστική απορρόφηση αλλά επηρεάζοντας και τη φλεγμονή και την ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος. Συνεπώς, είναι πιθανό μια διπλή αναστολή των πρωτεϊνών RANKL και TNF να προσφέρει καλύτερα θεραπευτικά αποτελέσματα στην Ρευματοειδή Αρθρίτιδα σε σχέση με τις υπάρχουσες θεραπείες αφού θα στόχευε ταυτόχρονα φλεγμονή και οστική καταστροφή.