Διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού δράσης της Geminin στα πρώιμα εμβρυϊκά βλαστικά νευρικά κύτταρα

Abstract

The cerebral cortex consists the outer layer of the mammalian brain and is one of the most complicated regions, characterised by excessive cell diversity. The cortex derives from the neural tube through a strictly regulated process that involves the generation of diverse types of neural stem and progenitor cells organised in discrete proliferating zones. Through the coordinated action of signalling molecules and transcription factors, cortical neurons are generated in the proliferating zones and subsequently they migrate radially towards the cortical plate. Additional intrinsic factors, like cell cycle regulation and chromatin landscape, are involved in the cell fate choices of neural stem cells. Genetic or environmental factors that compromise the proliferation or the integrity of neural stem cells during early development can lead to defective brain development and neurodevelopmental disorders. The accumulation of genetic alterations that affect the physiological functions of cells and usually lead to increased DNA damage and uncontrolled proliferation, is known as genomic instability. One of the main sources of genomic instability is replication stress which is described as DNA synthesis slow down or stalling of replication fork. Interestingly, replication stress-induced genomic instability during early development has been associated with microcephaly in humans. Geminin is a known nuclear protein that is characterised as a DNA replication inhibitor and as a molecule that is involved in cell fate choices. Here, we show that Geminin is essential for brain development in order to secure genome integrity during the early stages of cortical formation. In vivo deletion of Geminin from the neuroepithelial cells of the developing cortex caused increased accumulation of double strand breaks due to persistent replication stress, leading to cell cycle and mitotic defects. These aberrations were sufficient to induce apoptosis leading to a significant decrease in the stem cells pool and eventually to microcephaly. On the other hand, deletion of Geminin from radial glia cells did not cause replication stress or brain malformations. In order to elucidate the differential response between neuroepithelial and radial glia cells to Geminin deletion, we investigated possible differences in the regulation of the early events of DNA replication between the two populations. We have provided evidence that neuroepithelial cells license and fire more origins in order to complete DNA replication compared to radial glia cells. Additionally, we examined whether the length of the G1 phase, a well-described difference between neuroepithelial and radial glia cells contributes to the observed differences the exhibit the two populations upon Geminin. Establishing an in vitro system that permits the manipulation of G1 length we showed that the genomic instability caused by Geminin deletion is amplified as the G1 length decreases. We suggest that Geminin is essential for the establishment of a robust population of neuroepithelial cells early brain development. Our results support the dynamic regulation of DNA replication during cortical development suggesting that the protective role of Geminin in the maintenance of genome integrity during early development is defined by the intrinsic features of neuroepithelial cells.

Ο φλοιός αποτελεί την εξωτερική στιβάδα του εγκεφάλου των θηλαστικών και είναι μία δομή που χαρακτηρίζεται από υψηλή κυτταρική ετερογένεια και πλούσια συνδεσιμότητα. Η ανάπτυξη του φλοιού αποτελεί μία διαδικασία που αρχίζει κατά τα αρχικά εμβρυϊκά στάδια και βασίζεται στη δημιουργία διακριτών πληθυσμών νευρικών βλαστικών και προγονικών κυττάρων τα οποία οργανώνονται σε νευρογενετικές ζώνες. Οι φλοιικοί νευρώνες δημιουργούνται σταδιακά στις νευρογενετικές ζώνες μέσω της συντονισμένης δράσης σηματοδοτικών μορίων και μεταγραφικών παραγόντων. Επιπρόσθετα ενδογενή χαρακτηριστικά των νευρικών βλαστικών κυττάρων, όπως η οργάνωση της χρωματίνης και η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου συμβάλουν στις διαδικασίες αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης των νευρικών βλαστικών κυττάρων. Γενετικοί ή περιβαλλοντικοί παράγοντες οι οποίοι επηρεάζουν τις βασικές λειτουργίες των νευρικών βλαστικών κυττάρων κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη οδηγούν στην εμφάνιση νευροαναπτυξιακών ανωμαλιών και νευρολογικών διαταραχών. Πρόσφατα, η εμφάνιση γονιδιωματικής αστάθειας η οποία προκαλείται από το αντιγραφικό στρες συνδέθηκε με την εμφάνιση μικροκεφαλίας. Η γονιδιωματική αστάθεια αποτελεί μία κατάσταση η οποία προκαλείται από τη συσσώρευση γενετικών τροποποιήσεων επηρεάζοντας τις βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Το αντιγραφικό στρες, το οποίο ορίζεται ως η επιβράδυνση ή η πλήρης διακοπή της αντιγραφής του DNA αποτελεί μία από τις πηγές γονιδιωματικής αστάθειας. H Geminin αποτελεί μία πρωτεΐνη η οποία έχει χαρακτηρισθεί για τον διττό ρόλο που έχει στη ρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής του DNA και στις αποφάσεις διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης εργασίας καταδεικνύουν ότι η Geminin είναι απαραίτητη για τη διασφάλιση της γονιδιωματικής σταθερότητας των νευροεπιθηλιακών κυττάρων τα οποία αποτελούν τον πρωταρχικό πληθυσμό νευρικών βλαστικών κυττάρων του εγκεφαλικού φλοιού. In vivo απαλοιφή της Geminin από τα νευροεπιθηλιακά κύτταρα εμβρύων μυών προκάλεσε τη συσσώρευση βλαβών στο DNA λόγω αντιγραφικού στρες τα οποία οδήγησαν στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου καθώς και σε ανωμαλίες κατά τον διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων. Τα παραπάνω είχαν ως αποτέλεσμα τον μειωμένο πολλαπλασιασμό και τελικά την απόπτωση των νευροεπιθηλιακών κυττάρων. Η δραματική μείωση των νευρικών βλαστικών κυττάρων είχε ως αποτέλεσμα τη διακοπή της φυσιολογικής ανάπτυξης του φλοιού προκαλώντας στα έμβρυα μυών τον φαινότυπο της μικροκεφαλίας. Επιπρόσθετη ανάλυση κατέδειξε ότι ο προστατευτικός ρόλος της Geminin έναντι του αντιγραφικού στρες χαρακτηρίζει μόνο τα νευροεπιθηλιακά κύτταρα, καθώς η ανάλυση που πραγματοποιήθηκε στα κύτταρα ακτινωτής γλοίας του αναπτυσσόμενου φλοιού δεν είχε παρόμοια αποτελέσματα. Προκειμένου να αποσαφηνίσουμε τη διαφορετική απόκριση των νευροεπιθηλιακών και των κυττάρων ακτινωτής γλοίας στην αποσιώπηση της Geminin εξετάσαμε ενδογενείς διαφορές μεταξύ των δύο πληθυσμών στις διαδικασίες αδειοδότησης και έναρξης της αντιγραφής του DNA. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν ότι τα νευροεπιθηλιακά κύτταρα αδειοδοτούν και χρησιμοποιούν περισσότερες αφετηρίες προκειμένου να ολοκληρώσουν την αντιγραφή του DNA σε σχέση με τα κύτταρα ακτινωτής γλοίας. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν η αυξημένη ευαισθησία των νευροεπιθηλιακών κυττάρων στην αποσιώπηση της Geminin οφείλεται στη σύντομη G1 φάση που τα χαρακτηρίζει. Χρησιμοποιώντας ένα in vitro σύστημα το οποίο μας επιτρέπει να ελέγχουμε τη διάρκεια της G1 δείξαμε ότι η γονιδιωματική αστάθεια η οποία προκαλείται από την αποσιώπηση της Geminin ενισχύεται καθώς η διάρκεια της G1 φάσης μειώνεται. Συνοψίζοντας, προτείνεται ότι η Geminin είναι απαραίτητη κατά τα αρχικά στάδια ανάπτυξης του εγκεφαλικού φλοιού προκειμένου να διασφαλίσει την ακεραιότητα του πληθυσμού των νευροεπιθηλιακών κυττάρων. Τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν τη δυναμική ρύθμιση των διαδικασιών έναρξης της αντιγραφής κατά την ανάπτυξη του φλοιού προτείνοντας ότι ο ρόλος της Geminin στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας εξαρτάται από τα ενδογενή χαρακτηριστικά των διακριτών πληθυσμών νευρικών βλαστικών και προγονικών κυττάρων που σχηματίζονται κατά την ανάπτυξη του φλοιού.