Μελέτη του επιπέδου μεθυλίωσης και γονιδιακής έκφρασης σε δείγματα ομφαλοπλακουντιακού αίματος

Abstract

Genomic imprinting has a central role in human development and is essential to placental functions that regulate normal fetal growth. Genes that are subject to genomic imprinting are expressed in a parent-of-origin specific manner and may influence fetal growth through effects on placental function and nutrient metabolism. Dysregulation of imprinted gene methylation has been repeatedly proposed as a key molecular mechanism linking developmental exposures with adverse health outcomes later in life. Recent studies have elucidated the role of imprinted genes, including IGF2, MEST and PEG10, in determining fetal growth and found support for the importance of genomic imprinting in fetal development. IGF2, MEST and PEG10 imprinted genes have a broad developmental effect on fetal growth and birth weight variation. Impaired methylation and expression of these genes is associated to adverse fetal growth, pre-term birth, low birth weight, metabolic disorders and cognitive impairment. Several environmental stressors, including birth stress and conception through assisted reproductive technologies (ART), can affect the pattern of the abovementioned genes, resulting in differential DNA methylation/expression levels and increased risk of disease. Vaginal delivery (VD) of infants exposes them to stressors absent in caesarean section (CS), such as a surge of stress hormones which in turn can trigger cytokine and hormonal cascades preparing the infant for extrauterine life. Concerning stress at cellular level, an isoform of Oct4 transcription factor, Oct4B1, has emerged as a putative cell stress marker, resulting in differential expression levels under altered stress conditions. Manipulations during ART, including handling of gametes, ovarian stimulation and in vitro culture, represent artificial interventions, which coincide with critical windows for epigenetic reprogramming and expose the developing epigenome to stress factors that may result in aberrant establishment and maintenance of genomic imprints, leading to an increase in congenital malformations and imprinting disorders. Given that epigenetic modification is sensitive to environmental factors, such as various stressors, concerns are raised about future implications of the increasing prevalence in elective CS deliveries and the use of ART.In the present study we investigated the expression level of Oct4B1 and HERV-W1, and the expression and methylation status of IGF2, MEST and PEG10 imprinted genes in samples of umbilical cord blood (UCB) of newborns with different modes of conception and delivery. UCB samples were collected during delivery time from 40 enrolled participants. The samples were subdivided in 4 groups comprised of 10 participants each. The groups examined were VD (control group), CS with cephalic projection of the embryo and CS with breech embryo projection. The fourth consisted of infants conceived through ART (IVF and ICSI). This is the first study on the expression and methylation of those genes that correlates them to embryo presentation during CS and the first to evaluate the Oct4B1 levels in UCB samples.The results indicate that different modes of conception and delivery do not alter significantly the mRNA expression levels for Oct4B1 (p=0,58), IGF2 (p=0,96), MEST (p=0,75) and PEG10 (p=0,37) in UCB. There was a trend for increased expression of PEG10 in the CS with breech embryo projection group, a finding that warrants further investigation in broader sample studies. These results could be attributed to the small sample size available, but also to the extremely strict inclusion criteria that were employed. HERV-W1 showed no expression in our samples. Methylation analysis revealed the presence of both methylated and unmethylated alleles for IGF2, MEST and PEG10 imprinted genes, with no methylation differences reported between groups. Methylation analysis was not possible for Oct4B1 due to the existence of alternative promoters for this isoform, unknown so far. Methylation status of all genes is in consistence with non statistical differences in expression. These results are the first reported in cephalic and breech presentation CS concerning these specific genes. As far as the ART group is concerned, our results are consistent with some of the previous reports. However, there are other studies reporting altered DNA methylation and expression levels of these genes after ART treatments. It is necessary to understand health risks and underlying molecular mechanisms of ART interventions, for the purpose of increasing the safety of these techniques. Thus, the contradictory literature results call for caution and for larger studies. This doctorate thesis aims to stress the importance of evaluating the effect of environmental stressors on the epigenome. It can be considered as a starting point for more thorough investigations on the role of imprinted genes and Oct4B1 isoform on the regulation of human reproduction.

Το γονιδιακό εντύπωμα παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του ανθρώπου και είναι απαραίτητη για τη λειτουργία του πλακούντα και τη ρύθμιση της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα γονίδια που υπόκεινται σε γονιδιακή εντύπωση εκφράζονται μονο-αλληλικά, αναλόγως του γονέα από τον οποίο κληρονομούνται και επηρεάζουν την εμβρυϊκή ανάπτυξη μέσω επιδράσεων στη λειτουργία του πλακούντα και του μεταβολισμού των θρεπτικών συστατικών. Η λανθασμένη μεθυλίωση των εντυπωμένων γονιδίων έχει επανειλημμένως προταθεί ως ο βασικός μοριακός μηχανισμός που συνδέει τις αρνητικές επιδράσεις περιβαλλοντικών παραγόντων με την εμφάνιση προβλημάτων υγείας στη διάρκεια της ζωής. Τα αποτελέσματα πρόσφατων μελετών έχουν αποσαφηνίσει το ρόλο πολλών εντυπωμένων γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των IGF2, MEST και PEG10, στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και τονίζουν τη σημασία του γονιδιακού εντυπώματος στη σωστή λειτουργία και ανάπτυξη του οργανισμού. Τα IGF2, MEST and PEG10 εντυπωμένα γονίδια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του εμβρύου και στον καθορισμό του βάρους γέννησης. Λανθασμένη έκφραση και μεθυλίωση αυτών των γονιδίων σχετίζεται με ανωμαλίες στην ανάπτυξη, πρόωρο τοκετό, χαμηλό βάρος γέννησης, εμφάνιση μεταβολικών συνδρόμων και νοητική υστέρηση. Η επίδραση πολλών περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως είναι το στρες κατά τον τοκετό και η σύλληψη μέσω εφαρμογής τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (ART), μπορούν να επηρεάσουν το επιγενετικό πρότυπο των ανωτέρω γονιδίων και να οδηγήσουν σε αλλαγές στα επίπεδα μεθυλίωσης/έκφρασης με αποτέλεσμα την εμφάνιση ασθενειών. Κατά τη διάρκεια του φυσιολογικού τοκετού το έμβρυο εκτίθεται σε παράγοντες που εκλείπουν κατά την καισαρική τομή, όπως είναι το υψηλό κύμα ορμονών του στρες, το οποίο πυροδοτεί την παραγωγή κυτοκινών και άλλων ορμονών, προετοιμάζοντας το νεογνό για τη ζωή έξω από τη μήτρα. Σε κυτταρικό επίπεδο, η ισομορφή Oct4B1 του Oct4 μεταγραφικού παράγοντα φαίνεται να αποτελεί δείκτη απόκρισης του κυττάρου στο στρες, παρουσιάζοντας αυξημένα επίπεδα έκφρασης κάτω από στρεσσογόνες συνθήκες. Οι χειρισμοί και οι διαδικασίες κατά την εξωσωματική γονιμοποίηση, συμπεριλαμβανομένων του χειρισμού των γαμετών, της ωοθηκικής διέγερσης και της in vitro καλλιέργειας, αποτελούν τεχνητές παρεμβάσεις, που συμπίπτουν χρονικά με κρίσιμα στάδια επιγενετικής ρύθμισης και εκθέτουν το αναπτυσσόμενο επιγονιδίωμα σε στρεσσογόνους περιβαλλοντικούς παράγοντες που μπορεί να οδηγήσουν σε λανθασμένη δημιουργία και διατήρηση του γενωμικού εντυπώματος. Δεδομένου ότι οι επιγενετικές διεργασίες είναι ευαίσθητες στην επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων, η αύξηση της συχνότητας των καισαρικών τομών και της εφαρμογής τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής έχει δημιουργήσει πολλές ανησυχίες για τις μελλοντικές συνέπειές τους στην υγεία των ατόμων.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των επιπέδων έκφρασης της Oct4B1 ισομορφής και του μεταθετού στοιχείου HERV-W1, καθώς και των επιπέδων έκφρασης και μεθυλίωσης των IGF2, MEST και PEG10 εντυπωμένων γονιδίων σε δείγματα ομφαλοπλακουντιακού αίματος (UCB) νεογνών που γεννήθηκαν ύστερα από διαφορετικό τρόπο σύλληψης και τοκετού. Η μελέτη περιελάμβανε 4 διαφορετικές ομάδες μελέτης με 10 UCB δείγματα ανά ομάδα. Οι ομάδες μελέτης αποτελούνταν από νεογνά φυσιολογικού τοκετού (control group), καισαρικής τομής κεφαλικής προβολής και καισαρικής τομής ισχιακής προβολής. Η τέταρτη ομάδα αποτελούνταν από νεογνά που γεννήθηκαν ύστερα από την εφαρμογή ART μεθόδων. Η συγκεκριμένη μελέτη αποτελεί την πρώτη αναφορά που προσπαθεί να συσχετίσει την έκφραση και μεθυλίωση των ανωτέρω γονιδίων με την προβολή το εμβρύου κατά την καισαρική τομή, καθώς και την πρώτη μελέτη που προσπαθεί να αξιολογήσει την έκφραση της Oct4B1 σε UCB δείγματα.Τα αποτελέσματα της διατριβής υποδεικνύουν ότι ο διαφορετικός τρόπος σύλληψης και τοκετού δεν προκαλεί στατιστικώς σημαντική αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης των Oct4B1 (p=0,58), IGF2 (p=0,96), MEST (p=0,75) και PEG10 (p=0,37) γονιδίων στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα. Υπήρξε μια τάση για αυξημένη έκφραση του PEG10 γονιδίου στην ομάδα καισαρικής τομής με κεφαλική προβολή του εμβρύου, αλλά το αποτέλεσμα αυτό πρέπει να αξιολογηθεί σε μελέτες με μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος. Τα αρνητικά αυτά αποτελέσματα μπορούν να αποδοθούν στο μικρό μέγεθος δείγματος, αλλά και στα αυστηρά κριτήρια επιλογής που εφαρμόστηκαν ώστε τα αποτελέσματα να είναι πιο αξιόπιστα. Για το γονίδιο HERV-W1 δεν παρατηρήθηκε έκφραση στα δείγματα της μελέτης μας. Η ανάλυση της μεθυλίωσης του DNA ανέδειξε την παρουσία τόσο των μη μεθυλιωμένων όσο και των μεθυλιωμένων αλληλομόρφων των IGF2, MEST και PEG10 εντυπωμένων γονιδίων, χωρίς να παρουσιάζονται διαφορές μεταξύ των διαφορετικών ομάδων μελέτης. Η ανάλυση της μεθυλίωσης της Oct4B1 δεν ήταν δυνατή, καθώς η συγκεκριμένη ισομορφή μεταγράφεται από διαφορετικούς υποκινητές, οι οποίοι είναι άγνωστοι μέχρι στιγμής. Τα αποτελέσματα της μεθυλίωσης όλων των γονιδίων βρίσκονται σε συμφωνία με τα αντίστοιχα αποτελέσματα έκφρασης. Τα ανωτέρω αποτελέσματα είναι τα πρώτα που αναφέρονται σε περιστατικά καισαρικής τομής κεφαλικής και ισχιακής προβολής και αφορούν τα συγκεκριμένα γονίδια. Όσον αφορά την ομάδα των νεογνών που γεννήθηκαν ύστερα από την εφαρμογή τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής, τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με προηγούμενες βιβλιογραφικές αναφορές. Παρόλα αυτά, υπάρχουν και μελέτες που αναφέρουν αλλαγές στα επίπεδα μεθυλίωσης DNA και έκφρασης αυτών των γονιδίων ύστερα από εφαρμογή ART τεχνικών. Κρίνεται απαραίτητο να κατανοήσουμε τους υποκείμενους μηχανισμούς δράσης των ART τεχνικών, προκειμένου να αυξηθεί η ασφάλεια αυτών των τεχνικών και να προληφθούν πιθανές επιπτώσεις στην υγεία. Γι αυτόν το λόγο, πρέπει να αποσαφηνιστούν τα αντικρουόμενα αποτελέσματα που υπάρχουν στη διεθνή βιβλιογραφία μέσω μεγαλύτερων και καλύτερα οριοθετημένων μελετών. Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως στόχο να τονίσει τη σημασία της αξιολόγησης των περιβαλλοντικών επιδράσεων στο επιγονιδίωμα. Θα μπορούσε να αποτελέσει ένα πρώτο βήμα για περισσότερο διεξοδικές αναλύσεις όσον αφορά το ρόλο των εντυπωμένων γονιδίων και της Oct4B1 ισομορφής στη ρύθμιση της ανθρώπινης αναπαραγωγής.